TB 1 LU蝙蝠肺细胞的应用

背景^[1-3]

TB 1 LU蝙蝠肺细胞分离自蝙蝠肺组织形态为贴壁生长。肺是机体的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆盖于心之上。肺有分叶，左二右三，共五叶。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍。肺泡由单层上皮细胞构成的半球状囊泡。肺中的支气管经多次反复分枝成无数细支气管，它们的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即为肺泡。

细胞复苏操作步骤：

1．将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻；

2．当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒；

3．将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中；

4．细胞悬液在4℃下200磄离心10分钟；

5．弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中；

6．将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养；

7．是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。

收到细胞后，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，仅留下10ml培养液在瓶内继续培养。

（二）如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1.弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来。

3.加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。1:3~1:6传代；2~3天1次。

应用^[4][5]

用于蝙蝠宿主中新病毒发现及蝙蝠冠状病毒HKU9受体的探索研究

通过泛冠状病毒RT-PCR筛选(pan-coronaviral screening)和新一代测序技术,从棕果蝠(Rousettus leschenaulti)的直肠拭子样本中鉴定出一种新型蝙蝠冠状病毒,将其命名为果蝠冠状病毒GCCDC1(Rousettus bat coronavirus GCCDC1,Ro-BatCoV GCCDC1)。Ro-BatCoV GCCDC1在基因组结构和组成上与果蝠冠状病毒HKU9(Ro-BatCoV HKU9)类似,但是序列和进化分析表明Ro-BatCoV GCCDC1是一种新型蝙蝠冠状病毒。

更为引人注意的是,在病毒基因组的3’末端整合有一个独特的基因——p10基因,这个基因在所有已知的冠状病毒中都找不到同源序列,序列和进化分析表明可能来源于一个古老的蝙蝠正呼肠孤病毒。亚基因组mRNA和细胞水平试验表明Ro-BatCoV GCCDC1的p10基因与正呼肠孤病毒的p10基因一样是一个功能基因。在病毒复制周期中,p10基因可能能够促进病毒在细胞与细胞之间转移。

参考文献

[1]Evidence for an Ancestral Association of Human Coronavirus 229E with Bats[J].Corman Victor Max,Baldwin Heather J.,Tateno Adriana Fumie,Zerbinati Rodrigo Melim,Annan Augustina,Owusu Michael,Nkrumah Evans Ewald,Maganga Gael Darren,Oppong Samuel,Adu-Sarkodie Yaw,Vallo Peter,da Silva Filho Luiz Vicente Ribeiro Ferreira,Leroy Eric M.,Thiel Volker,van der Hoek Lia,Poon Leo L.M.,Tschapka Marco,Drosten Christian,Drexler Jan Felix.Journal of Virology.2015(23)

[2]A Systematic Approach to Novel Virus Discovery in Emerging Infectious Disease Outbreaks[J].Siddharth Sridhar,Kelvin K.W.To,Jasper F.W.Chan,Susanna K.P.Lau,Patrick C.Y.Woo,Kwok-Yung Yuen.The Journal of Molecular Diagnostics.2015(3)

[3]Reovirus FAST proteins:virus-encoded cellular fusogens[J].Marta Ciechonska,Roy Duncan.Trends in Microbiology.2014(12)

[4]Evidence for Camel-to-Human Transmission of MERS Coronavirus[J].Esam I.Azhar,Sherif A.El-Kafrawy,Suha A.Farraj,Ahmed M.Hassan,Muneera S.Al-Saeed,Anwar M.Hashem,Tariq A.Madani.The New England Journal of Medicine.2014(26)

[5]黄灿平.蝙蝠宿主中新病毒发现及蝙蝠冠状病毒HKU9受体的探索[D].中国疾病预防控制中心,2017.