封闭用驴血清(冻干粉) 的主要应用

背景^[1-3]

封闭用驴血清(冻干粉)适用于免疫组化或者免疫荧光实验中样本的封闭。可以封闭待检样本中与蛋白质非特异性结合的位点，另外还可以封闭样品中内源性的Fc片段结合位点，阻断抗体与样品中的Fc受体结合，从而降低背景，减少假阳性。在选择封闭血清时，要注意封闭用血清中不能含有目标蛋白，且与一抗来源不同，可用与二抗相同来源的封闭血清。

加封闭液是为了消除抗体与固相支持物表面孔穴的非特异结合．因为抗原很难完全包被于固相支持物（如硝酸纤维素膜，组织等）孔穴表面（即存在未被抗原包被的区域），因此，抗体或试剂与孔穴表面会产生非特异性结合，影响实验结果．为了解决这仪问题，在孔穴吸附抗原后，加入一种过量的与抗原或抗体无反应的物质（称为封闭液，多用蛋白封闭），封闭可能与抗体结合的孔穴，以提高检测方法的精确度．免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

使用方法：

使用时，用PBS（0.01mol/L pH7.2-7.4）将正常血清稀释10-20倍，直接滴加在组织切片或者细胞涂片上，37℃度10-30分钟，清除血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液，37℃孵育1-2h或4℃。

应用^[4][5]

封闭用驴血清(冻干粉)用于驴血清PMSG免疫学早期妊娠诊断方法的研究。

通过孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG）免疫检测条件、配种后PMSG检出时期和PMSG血清免疫学检测符合率验证三部分内容,建立了成熟的PMSG检测方法,为驴早期妊娠检测纸条的制备奠定基础。研究结果如下:建立PMSG免疫学检测方法。通过SDS-PAGE检测了PMSG抗原的纯度,Dot blot方法验证了能够与PMSG结合的抗体,采用Western Blot验证了PMSG与抗体以空间表位方式结合,并进一步通过ELISA方法建立PMSG浓度与吸光度值的酶标曲线,拟合方程为y=0.0045x+0.0202,R2=0.998;母驴妊娠后PMSG分泌规律。采集配种后第2、3、4、5、6、7和8周的母驴血清,使用ELISA酶联免疫方法测定血清PMSG含量。从第5周开始,可检测到血清PMSG,且含量逐步增加,50 d达到峰值80 IU·mL-1,后续开始下降;临床验证。

挑选15头配种母驴,并且直肠检查孕驴15头,利用本试验建立起来的血清免疫学检测方法检测配种5周后母驴血清,发现孕驴7头,未妊娠驴8头,孕驴阳性临床符合率为46.7%,检测配种6周后母驴血清,发现孕驴14头,未妊娠驴1头,孕驴阳性临床符合率为93.3%。检测配种7周后母驴血清,发现孕驴15头,未妊娠驴0头,孕驴阳性临床符合率为100%。空怀母驴阴性对照15头,血清免疫学检测方法检测为15头,阴性临床符合率为100%。综上,通过血清PMSG酶联免疫检测早期妊娠母驴的检测时期为配种5周后,检测时期为配种后6或7周。

参考文献

[1]A western blot assay to measure cyclin dependent kinase activity in cells or in vitro without the use of radioisotopes[J].Cody W.Lewis,Ryan G.Taylor,Philip M.Kubara,Kris Marshall,Laurent Meijer,Roy M.Golsteyn.FEBS Letters.2013(18)

[2]Early pregnancy diagnosis in dairy cows using circulating nucleic acids[J].Jennifer Mayer,Jan T.Soller,Julia Beck,Vanessa Purwins,Wilhelm Wemheuer,Ekkehard Schütz,Bertram Brenig.Theriogenology.2013(1)

[3]Early pregnancy diagnosis by palpation per rectum:Influence on embryo/fetal viability in dairy cattle[J].Juan E.Romano,James A.Thompson,Duane C.Kraemer,Mark E.Westhusin,David W.Forrest,Michael A.Tomaszweski.Theriogenology.2006(3)

[4]Applications of an efficient method for comparing immunogold labelling patterns in the same sets of compartments in different groups of cells[J].Terry M.Mayhew,Gareth Griffiths,John M.Lucocq.Histochemistry and Cell Biology.2004(2)

[5]于艳昌.驴血清PMSG免疫学早期妊娠诊断方法的研究[D].河北农业大学,2019.