DNA连接酶3抗体的应用

背景^[1-3]

DNA连接酶3抗体是一类可以特异性结合DNA连接酶3的一类多克隆抗体，主要用于检测DNA连接酶3的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。

DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是把两条DNA黏合成一条。无论是双股或是单股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸酯键将DNA在3'端的尾端与5'端的前端连在一起。

虽然在细胞内也有其他的蛋白质，例如像是DNA聚合酶在其中一股DNA为模版的情况下，将另一边的DNA单股断裂端，通过聚合反应的过程形成磷酸双脂键（phosphodiester bond）来黏合DNA(DNA连接酶将DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸双脂键)。

但是DNA聚合酶的黏合过程却只是聚合反应一个附带的功能而已，真正在细胞内扮演DNA黏合反应的工作还是以DNA黏合酶为主。DNA黏合酶的功能便是黏合断裂的DNA，而细胞内只有DNA复制与DNA修复的反应牵涉到DNA断裂的合成，因此DNA黏合酶就是在上述的两个机制扮演重要的角色。

除了细胞内的黏合反应，随着分子生物学的进展，几乎大多数的分子生物实验室都会利用DNA黏合酶来进行重组DNA的实验，或许这也可以被规类为其另一种重要的功能。

应用^[4][5]

用于肝癌相关抗原CD147/HAb18G基因原核表达载体构建、表达、产物纯化及体外生物活性检测

构建CD147/HAb18G基因原核表达载体并尝试在原核表达系统表达CD147/HAb18G蛋白，大量制备供筛选新型单抗的CD147/HAb18G抗原是本课题的首要目的。同时，原核表达的CD147/HAb18G蛋白是否具有抗原性，是决定利用原核表达的HAb18G蛋白筛选新型HAb18单抗能否取得突破性进展的关键所在。

因此，用纯化的CD147/HAb18G原核表达蛋白进行抗原性检测，是本课题的核心内容。天然CD147/HAb18G蛋白具有刺激肝癌及其周围组织中成纤维细胞(fb)产生基质金属蛋白酶MMPs(Matrix Metalloproteinases)的作用。MMPs具有破坏局部组织结构和基底膜屏障、促进肿瘤血管生成的作用。

方法：CD147／HAblSG基因原核表达载体的构建用PCR方法扩增HAb ISG全长CDNA，将片段CDNA及质粒载体pRSET双酶切后用T；DNA连接酶将二者连接，构建表达载体的。将表达载体进行酶切鉴定，并通过测序来验证插入片段的正确性。

CD 47AfAb SG基因在大肠杆菌BLZ VDE3）中的高效表达将重组表达载体pRSET－C一HAbl8G转染E．COlt BLZI（DE3）IPTG诱导下表达蛋白，SDS－PAGE检测蛋白表达，激光薄层扫描检测蛋白表达量占菌体蛋白总量的百分比。CD 47MAb SG融合蛋白的纯化及鉴定将表达的融合蛋白用Ni－NTA柱亲和层析纯化，SDS－PAGE检测纯化效果，观察纯化后融合蛋白的分子量验证表达蛋白的正确性。

CD 47fHAb SG原核表达蛋白的生物学活性检测1．利用纯化后融合蛋白进行酶联免疫吸附测定。

参考文献

[1]degragation of basment membrane Type IV collagen and lung subendothelial metrix by rat mammary adenocarcinoma cell clones of differing metastatic potential.Nakajima M,Welch DR,Belloni PN,et al.Cancer Research.1987

[2]radioimmunology-imaging and therapy.Larson SM.Cancer.1991

[3]Human keratinocytes Express EMMPRIN,an Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer.Decastro R,Zhang.Y,Guo H,et al.J.InvestDermatol.1996

[4]Cell surface iramunophenotype and gelatinase activity of the human breast carcinoma cell line(MCF-7/6)with functionally defective E-cadherin.Hlavcak P,Sedlakova 0,Sedlak J,et al.Neoplasma.1999

[5]许鹏.肝癌相关抗原CD147/HAb18G基因原核表达载体构建、表达、产物纯化及体外生物活性检测[D].第四军医大学,2002.