杂交瘤细胞无血清培养基的应用

背景^[1-3]

杂交瘤细胞无血清培养基是化学成分明确、使用中不需添加血清的培养基，用于杂交瘤细胞的培养，以获取特定的单克隆抗体。使用杂交瘤细胞无血清培养基可简化后期蛋白纯化的环节，获得高表达量的单克隆抗体。

无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清培养基含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质和清蛋白，纤维蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同的功能，如提供细胞贴壁所需的基质，抗生物反应器剪切力，作为脂质和其他生长分化因子的载体等。

杂交瘤细胞是一种能分泌单一独特抗体的无限传代细胞。杂交瘤细胞技术首先由英国的Kohler和Mistein在1975年通过小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合而建立的。杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体在诊断、免疫、纯化、疫苗生产、治疗和基础研究等方面有着广泛的应用，已成为生物工程方面的重要产品。

杂交瘤细胞的培养通常是在有血清培养基中进行的，虽然细胞密度和产物的浓度均较高，但由于血清中蛋白和其它大分子物质太复杂，影响了单克隆抗体的分离和纯化，使单克隆抗体的收率和纯度降低，限制了单克隆抗体的体内应用；同时，由于血清的添加也使生产成本大大提高。因此，许多科研工作者致力于开发无血清或低血清培养基。

应用^[4][5]

用于兔骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞的无血清培养驯化研究

针对兔单抗制备的工程细胞株,包括兔骨髓瘤细胞株和融合后的杂交瘤细胞株,开展无血清培养驯化,以去除培养基中血清成分。

首先,选取四种不同种类的无血清培养基对兔骨髓瘤细胞株(240E-W2)进行无血清驯化培养,比较分析直接替换的速降方式和逐步替换的缓降方式,探讨不同驯化方式和不同的培养基的影响。

发现1640AB培养基和CD Hybridoma Medium培养基按1:1配比,以缓降培养基内血清含量的方式,在贴壁培养的环境下从9%血清含量降至1%,经72h培养后细胞密度达4.0-5.0×105个/ml。

其次,进行无血清悬浮培养驯化,提高初始接种密度为1.2×105个/ml,在悬浮培养条件下从1%血清含量成功降至0,经过72h培养后细胞密度可达4.0-6.0X 105个/ml,细胞状态良好。

对细胞株进行多次亚克隆,挑选出最稳定的适应于无血清培养的兔骨髓瘤细胞株(240E-W2-SFM),建库保持。进一步筛选无血清冻存液,进行冻存复苏测试,以确保无血清冻存方式对细胞的生理活性没有负面影响。

最后,完全适应于无血清悬浮培养的兔骨髓瘤细胞株(240E-W2-SFM)与兔脾脏细胞进行融合,构建杂交瘤细胞株,进行常规9%血清浓度培养和无血清同步维护对比,考察酶联免疫吸附阳性率,蛋白免疫印迹法阳性率、丢失率等,比较分析无血清培养对于杂交瘤细胞株的影响。

参考文献

[1]In vitro co-culture model of medulloblastoma and human neural stem cells for drug delivery assessment[J].Delyan P.Ivanov,Terry L.Parker,David A.Walker,Cameron Alexander,Marianne B.Ashford,Paul R.Gellert,Martin C.Garnett.Journal of Biotechnology.2015

[2]Improved efficiency of definitive endoderm induction from human induced pluripotent stem cells in feeder and serum-free culture system[J].Hiromasa Ninomiya,Keiko Mizuno,Reiko Terada,Toshiyuki Miura,Kiyoshi Ohnuma,Shuji Takahashi,Makoto Asashima,Tatsuo Michiue.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.2015(1)

[3]The therapeutic monoclonal antibody market[J].Dawn M Ecker,Susan Dana Jones,Howard L Levine.mAbs.2015(1)

[4]Development of a new rabbit monoclonal antibody and its based competitive indirect enzyme‐linked immunosorbent assay for rapid detection of sulfonamides[J].Na Liu,Zheng Han,Lei Lu,Lin Wang,Geng Ni,Zhihui Zhao,Aibo Wu,Xiaodong Zheng.J.Sci.Food Agric.2012(3)

[5]朱晓黎.兔骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞的无血清培养驯化研究[D].浙江大学,2017.