人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA KIT用纯化的人芳基硫酸酯酶A(ASA)抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗人芳基硫酸酯酶A(ASA)指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。人芳基硫酸酯酶A(ASA)是催化苯酚硫酸酯水解成苯酚和硫酸的酶。有A、B、C三种类型。芳基硫酸酯酶A（ARSA）是一种溶酶体酶，可将脑磷脂3硫酸盐（髓磷脂片的主要成分）分解为脑苷脂和硫酸盐。ARSA缺乏会导致异色性白细胞营养不良（MLD），这是一种中枢神经系统和周围神经系统的溶酶体贮积病，具有严重和进行性神经症状。重组人ARSA对应于ARSA成熟肽，并具有硫酸酯酶活性。缺少芳基硫酸酯酶是导致异染性脑白质营养不良的原因之一。

应用^[4][5]

人芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA KIT用于产芳基硫酸酯酶菌株的筛选及酶学性质研究。

芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一种催化裂解硫酸酯键，生成相应的醇和无机硫酸根的酶，该酶可以脱除琼胶分子中的硫酸根，进而可以替代对环境污染严重、产品得率低的化学方法，用于制备高品质的琼脂糖。菌株经革兰氏染色为阴性，需氧，弯杆状，生理生化特征验证及16S rDNA序列分析确定为海单胞菌属，并将其命名为Marinomonas sp.FW-1，简称FW-1。证实了菌株FW-1的产酶能力后，选取常用的pNPS法对其产酶能力进行定量分析。采用单因素-响应面方法对菌株FW-1产芳基硫酸酯酶的培养条件及培养基成分进行优化。结果表明，其培养基组分为(w/v)：琼脂0.2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.5%，NaCl2.89%，MgCl2·6H200.412%，KCl0.1%，CaCl20.02%，K2HPO4·3H200.013%，FeCl2·4H2O0.002%，MnCl20.09%，焦磷酸钠0.043%，吐温-801.87%；培养条件如下：初始pH为7，培养温度为35℃，发酵时间为72h，接种量为1%，250mL锥形瓶装液量为50mL。在上述培养基成分及培养条件下，菌株FW-1的产酶能力为1.07U/mL，酶活力相对于优化前提高了4.28倍。

菌株FW-1能够稳定地产生芳基硫酸酯酶，该酶主要位于菌体细胞内部,在最适培养条件下发酵培养72h后，发酵液经低温离心、超声波细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、透析除盐、超滤浓缩、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原位检测及分离后得到粗酶液。纯度鉴定及分子量测定表明该酶的分子量约为60kDa。酶学性质实验表明，芳基硫酸酯酶的最适反应温度和pH分别是45℃和11。该酶在4℃以下保存时较为稳定，在4℃放置72h后，酶活仍保留在95%以上，酶的热稳定良好，25℃保温48h后，酶活剩余90%左右，但当温度大于35℃时，6h以后酶活就开始急剧下降。该酶在pH为7.0~11.0时具有良好的稳定性。当金属离子浓度为0.1mM/L时，K+、Ba2+和Ca2+对芳基硫酸酯酶酶活力具有显著的促进作用，Hg2+能够抑制芳基硫酸酯酶酶活力，酶活下降了59%；当离子浓度为1mM/L时，Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+及Ca2+对芳基硫酸酯酶酶活力具有显著的促进作用，Hg2+同样能够有效地抑制芳基硫酸酯酶酶活力，酶活大幅度下降了80%。利用纯化后的芳基硫酸酯酶对琼胶进行酶解实验，结果表明该酶可以有效地脱除琼胶中的硫酸根，对石花菜和江蓠琼胶的硫酸根脱除率分别为86.11%和89.61%。

参考文献

[1]Protein release from alginate matrices[J].Wayne R.Gombotz,Siow Fong Wee.Advanced Drug Delivery Reviews.2012

[2]Partial characterization of sulfohydrolase from Gracilaria dura and evaluation of its potential application in improvement of the agar quality[J].Mahendra K.Shukla,Manoj Kumar,Kamlesh Prasad,C.R.K.Reddy,Bhavanath Jha.Carbohydrate Polymers.2011(1)

[3]Practical and reliable enzyme test for the detection of Mucopolysaccharidosis IVA(Morquio Syndrome type A)in dried blood samples[J].Marli V.Camelier,Maira G.Burin,Jurema De Mari,Taiane A.Vieira,Giórgia Marasca,Roberto Giugliani.Clinica Chimica Acta.2011(19)

[4]Steroid sulfatase and estrogen sulfotransferase in human carcinomas[J].Takashi Suzuki,Yasuhiro Miki,Yasuhiro Nakamura,Kiyoshi Ito,Hironobu Sasano.Molecular and Cellular Endocrinology.2010(2)

[5]王志朋.产芳基硫酸酯酶菌株的筛选及酶学性质研究[D].中国海洋大学,2014.