人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)水平。收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。用纯化的人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)含量。

人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)是调节糖异生的主要控制点。人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)与GTP一起催化草酰乙酸生成磷酸烯醇丙酮酸，并释放二氧化碳和GDP。人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)表达可以通过胰岛素，糖皮质激素，胰高血糖素，cAMP和饮食来调节。

应用^[4][5]

人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)ELISA KIT用于磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在肿瘤再生细胞代谢过程中作用的研究。

采用三维软纤维蛋白基质胶(3D fibrin)分离筛选的肿瘤干细胞(定义为肿瘤再生细胞,TRCs)为模型,探究糖异生的关键酶之一的胞浆型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)在黑色素瘤再生细胞中的表达及其发挥的代谢功能。方法：(1)以3D fibrin分离小鼠黑色素瘤B16细胞、肝癌H22细胞、淋巴瘤EL4细胞中的TRCs,然后使用RT-PCR、Real time PCR和Western blot检测这些TRCs和相应对照细胞以及小鼠未分化的间充质干细胞(mMSCs)和胚胎干细胞(mESCs)中PCK1的表达。(2)使用癌症基因数据库cbioportal中的基因表达数据分析PCK1与CD133、ALDH1A1和ABCG5等常用肿瘤干细胞标志在多细胞中的共表达关系；并采用Real time PCR检测PCK1在CD133+与CD133-B16细胞亚群中的表达差异。(3)免疫组化检测PCK1在9例人黑色素瘤临床标本中的表达；分离人原代黑色素瘤新鲜标本中的TRCs,real time PCR检测PCK 1的表达情况。(4)RT-PCR和Western blot检测B16TRCs中糖异生的另外两个关键酶FBP1和G6Pase的表达情况,以探讨PCK1是否介导糖异生的反应。(5)以siRNA沉默PCK1的表达后,观察B16 TRCs体外生长、葡萄糖消耗、乳酸释放以及中间代谢产物(如丝氨酸／甘氨酸,三磷酸甘油)等的变化,以探究PCK1发挥的代谢功能。(6)以siRNA沉默B16或H22 TRCs中PCK1的表达,观察其在动物体内成瘤能力。(7)以siRNA沉默B16 TRCs中PCK1的表达后,补充相关中间代谢产物,以观察对克隆生长的影响。(8)观察PCK1过表达对B16 TRCs体外生长的影响。(9)构建PCK1启动子控制的EGFP荧光表达B16细胞,分离出该细胞中的TRCs并置于普通硬质环境下连续培养,采用荧光显微镜动态观察荧光变化。

参考文献

[1]Databases and Web Tools for Cancer Genomics Study[J].Yadong Yang,Xunong Dong,Bingbing Xie,Nan Ding,Juan Chen,Yongjun Li,Qian Zhang,Hongzhu Qu,Xiangdong Fang.Genomics,Proteomics&Bioinformatics.2015(01)

[2]CD133:A cancer stem cells marker,is used in colorectal cancers[J].Fei Ren,Wei-Qi Sheng,Xiang Du.World Journal of Gastroenterology.2013(17)

[3]Dysregulated lipid metabolism in cancer[J].Feng Zhang,Guangwei Du,Department of Integrative Biology and Pharmacology,The University of Texas Health Science Center at Houston,Houston,TX 77030,United States.World Journal of Biological Chemistry.2012(08)

[4]ABCG5-positivity in tumor buds is an indicator of poor prognosis in node-negative colorectal cancer patients[J].lsabel Hostettler,Inti Zlobec,Luigi Terracciano,Alessandro Lugli.World Journal of Gastroenterology.2010(06)

[5]李勇.磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在肿瘤再生细胞代谢过程中作用的研究[D].华中科技大学,2016.