兔子D二聚体(D2D)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

兔子D二聚体(D2D)ELISA试剂盒用于固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）。方法：已知D2D浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将D2D和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用，产生颜色。颜色的深浅和样品中D2D的活性浓度呈比例关系。

纤溶酶可分解纤维蛋白原和纤维蛋白，此酶是纤维蛋白溶解的关键酶。因此，纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物的测定是纤维蛋白溶解增高(高纤溶状态)的标志性指标。通常纤维蛋白在因子ⅩⅢa的作用下交联在血管壁上。这种交联的纤维蛋白在裂解时产生具有特异性的D-二聚体。D-二聚体(D-Dimer)快速检测，可用于快速对血栓性疾病如肺栓塞、深部静脉血栓等的鉴别诊断、监测病情和评估溶栓治疗效果。

操作步骤

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于血浆D-二聚体与年龄等影响因素的相关性研究

血浆D-二聚体(D-dimer,DD)足纤维蛋白在凝血因子ⅩⅢa作用下产生的交联纤维蛋白经血浆纤溶酶降解作用后的终产物之一,是继发性纤维蛋白溶解特有的标志物。D-二聚体因其水平长期保持稳定,有较长的半衰期,可以以抵抗体外激活,少有在健康人体内升高,成为血栓性疾病(如肺栓塞和深静脉血栓)的排外性诊断、溶栓治疗的监测、急性主动脉夹层形成的预测及癌症转移的重要检测指标。既往研究表明,影响血浆D-二聚体的因素主要有：年龄、血浆胆固醇水平、甘油三酯、肌酐水平、血沉、血红蛋白含量及体重指数,以上这些因素是影响血浆D-二聚体水平的危险因素。并随年龄增长而出现增高,分析原因是因为体内炎性前状态、胆固醇和甘油三酯含量等脂质物质升高、贫血和肥胖。

这些因素干扰了D-二聚体对血栓性疾病诊断评价。显而易见,应用D-二聚体检测指标排除老年人肺栓塞的价值受到一定的限制。健康人血浆D-二聚体水平随年龄增长而增高。并对形成的原因进行探讨,发现D-二聚体增高的原因与内皮因素的相关。因此检测D-二聚体对于预测老年人内皮损伤有一定的临床价值,同时血管内皮损伤是老年人多种疾病的危险因素。临床上对于D-二聚体升高的老年人,可据情况给予保护血管内皮治疗。

参考文献

[1]Fibrin D-Dimer,Tissue-Type Plasminogen Activator,von Willebrand Factor,and Risk of Incident Stroke in Older Men[J].S.Goya Wannamethee,Peter H.Whincup,Lucy Lennon,Ann Rumley,Gordon D.Lowe.Stroke.2012(5)

[2]Meta-Analysis of Usefulness of D-Dimer to Diagnose Acute Aortic Dissection[J].Avi Shimony,Kristian B.Filion,Salvatore Mottillo,Tara Dourian,Mark J.Eisenberg.The American Journal of Cardiology.2011(8)

[3]Genetic Predictors of Fibrin D-Dimer Levels in Healthy Adults[J].Circulation.2011(17)

[4]Biochemical markers for the diagnosis of venous thromboembolism:the past,present and future[J].Giuseppe Lippi,Gianfranco Cervellin,Massimo Franchini,Emmanuel J.Favaloro.Journal of Thrombosis and Thrombolysis.2010(4)

[5]李丹丹. 血浆D-二聚体与年龄等影响因素的相关性研究[D].南方医科大学,2012.