人胚肺二倍体细胞的应用

背景^[1-3]

人胚肺二倍体细胞是一株由人胚胎肺组织分离鉴定的有限细胞系，传代25代，可支撑多种人源病毒的复制，广泛用于病毒学基础研究。二倍体是指由受精卵发育而来，且体细胞中含有两个染色体组的生物个体。另外，由二倍体的体细胞培育而来的植物，以及由只含一组染色体组的单倍体经过染色体数目加倍处理而来的植物也叫二倍体。可用2n表示。人和几乎全部的高等动物，还有一半以上的高等植物都是二倍体。

二倍体细胞(diploid cell)具有有限的增殖能力，此增殖能力决定于供体的物种与年龄，如小鼠细胞分裂约12次，鸡细胞分裂约25次，成年人成纤维细胞体外能倍增20代，胚胎成纤维细胞能倍增50代，故可采用分离的二倍体细胞观察药物对寿命的影响，由于体外细胞的衰老与体内的衰老有一定相关性，可预测此药物有无抗衰老作用。

人胚肺二倍体细胞培养方法：

收到细胞后，在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：

如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，留10ml培养液继续培养。

如果细胞已长满（达80-90%）。即可进行传代，具体步骤如下：

a，弃去培养液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶内加入1.0-2.0ml胰蛋白酶液，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，吸取胰蛋白酶，加含有6ml含10%血清的培养液，轻轻吹打细胞。

c，加入等量的的培养液，轻轻吹打混匀后吸出一半，分到新的培养

d，传代比例：1:2-1:3

应用^[4][5]

用于人胚肺二倍体细胞衰老程度评价生物学指标研究

细胞衰老是随着时间的推移,细胞增殖能力和生理功能逐渐下降的变化过程,是个体衰老的重要基础。体外培养二倍体细胞是目前用于疫苗生产最安全的细胞基质,其使用代次限制在生命周期的三分之二以内。目前对不同代次二倍体细胞在细胞、蛋白及分子等不同层次的变化尚不清楚,缺乏评价二倍体细胞衰老程度的有效手段。研究二倍体细胞衰老特征变化,对生产用细胞基质安全评价以及衰老相关疾病研究具有重要意义。

以人胚肺二倍体细胞Walvax-2细胞为研究对象,在细胞显微结构、超微结构、酶学变化、蛋白表达以及细胞生长等不同水平,通过检测不同代次人胚肺二倍体细胞衰老相关标记物,筛选出能够评价人胚肺二倍体细胞衰老程度的可靠生物学指标。

方法：1.将Walvax-2细胞分20代、25代、30代、35代至45代、50代和55代共16个代次,其中35代到45代之间均隔1代；

2倒置显微镜下观察不同代次Walvax-2细胞显微结构及生长情况；

3. 透射电镜下观察不同代次Walvax-2细胞超微结构；

4. 以细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法检测不同代次Walvax-2细胞β-半乳糖苷酶表达；

5. 以TRAP-PCR方法检测不同代次Walvax-2细胞端粒酶活性；

6. 绘制作生长曲线,观察不同代次Walvax-2细胞生长增殖能力；

7.通过流式细胞仪检测不同代次Walvax-2细胞周期时相和细胞凋亡；8.Western印迹法检测不同代次Walvax-2细胞的P16基因和BMI-1基因的蛋白表达。

参考文献

[1]Generation of HIV-1 Gag VLPs by transient transfection of HEK 293 suspension cell cultures using an optimized animal-derived component free medium[J].Laura Cervera,Sonia Gutiérrez-Granados,Marta Martínez,JuliàBlanco,Francesc Gòdia,María Mercedes Segura.Journal of Biotechnology.2013(4)

[2]Effects of Alcohols and Compatible Solutes on the Activity ofβ-Galactosidase[J].Andrew N.W.Bell,Emma Magill,John E.Hallsworth,David J.Timson.Applied Biochemistry and Biotechnology.2013(3)

[3]Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor[J].Khaled Trabelsi,Samy Majoul,Samia Rourou,Héla Kallel.Applied Microbiology and Biotechnology.2012(3)

[4]Immortalization of ameloblastoma cells via reactivation of telomerase function:Phenotypic and molecular characteristics[J].Qian Tao,Biao Lv,Bin Qiao,Chao-qun Zheng,Zhi-feng Chen.Oral Oncology.2009(12)

[5]马立宇.人胚肺二倍体细胞衰老程度评价生物学指标研究[D].昆明医科大学,2015.