ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108的应用

背景^[1-3]

ROSETTA(DE3)感受态细胞-CB108是采用大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞。补充6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA），提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

基因型：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)

特点：1.含有pRARE质粒，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

2. 菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。具氯霉素抗性。pUC19质粒检测，转化效率可达108cfu/μg DNA。

使用说明：

1．取100μl感受态细胞置于冰浴中融化。

2．待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA（根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1 ng超螺旋质粒DNA所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。

3．42℃热击45sec，然后快速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3min，该过程不要摇动离心管。

4．每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45～60min使菌体复苏。

5．根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12~16h。

应用^[4][5]

用于人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

构建NGAL原核表达载体,并在原核细胞中诱导表达人NGAL的融合蛋白pET28a-NGAL,融合蛋白经纯化后作为抗原,免疫动物,制备多克隆抗体,为进一步阐明NGAL生物学功能奠定基础。

研究方法：1构建NGAL原核表达载体用RT-PCR方法从K562细胞株总RNA中克隆NGAL的cDNA片段,以此片段为模板行PCR,再将扩增片段与载体pET28a同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,回收后将目的片段连接入原核表达载体pET28a中,将NGAL原核表达质粒转化Ecoli Rosetta DE3、筛选阳性菌落、提取质粒后双酶切、载体测序引物进行测序。

将测序结果和NGAL基因的ORF序列及pET28a载体多克隆位点进行同源比较,检测原核表达载体pET28a-NGAL克隆正确。2 pET28a-NGAL融合蛋白的诱导表达pET28a及表达载体pET28a-NGAL转化大肠杆菌Rosetta DE3,菌落PCR、再小量提质粒后,行双酶切和测序鉴定正确后。

再以最终浓度为1mM IPTG诱导目的蛋白在Rosetta DE3中表达,目的蛋白诱导表达3h后,分别收集上清液和沉淀,再行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,凝胶成像分析电泳图像,融合蛋白表达率由Quantity One分析所得。

参考文献

[1]Accuracy of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin(NGAL)in Diagnosis and Prognosis in Acute Kidney Injury:A Systematic Review and Meta-analysis[J].Michael Haase,Rinaldo Bellomo,Prasad Devarajan,Peter Schlattmann,Anja Haase-Fielitz.American Journal of Kidney Diseases.2009(6)

[2]Cachexia,survival and the acute phase response[J].Nathan A Stephens,Richard JE Skipworth,Kenneth CH Fearon.Current Opinion in Supportive and Palliative Care.2008(4)

[3]Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expression in chronic myeloid leukemia[J].Claire Villalva,Nathalie Sorel,Marie-Laure Bonnet,Joë,lle Guilhot,Caroline Mayeur-Rousse,Franç,ois Guilhot,Jean-Claude Chomel,Ali G.Turhan.Leukemia&Lymphoma.2008(5)

[4]Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)is a predictor of poor prognosis in human primary breast cancer[J].Maret Bauer,Jens C.Eickhoff,Michael N.Gould,Christoph Mundhenke,Nicolai Maass,Andreas Friedl.Breast Cancer Research and Treatment.2008(3)

[5]熊火梅.人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备[D].南昌大学,2011.