兔抗鸡卵清蛋白抗血清应用

背景^[1-3]

兔抗鸡卵清蛋白抗血清是用鸡卵清蛋白对无菌家兔进行系统免疫后在其血液中制得的免疫血清。蛋清中的主要蛋白质包括卵清蛋白、卵转铁球蛋白、类卵沾蛋白、卵沾蛋白、溶菌酶、球蛋白G2、球蛋白G3等。卵清蛋白等电点4.5，其本质是含磷糖蛋白。卵清蛋白是蛋清中的主要蛋白组分，其结构与性质会显著影响蛋清蛋白在食品加工过程中的功能性质。因此研究卵清蛋白在热处理或美拉德反应后的变化对了解蛋清蛋白在食品加工过程中的结构与性质的变化有重要意义。

卵清蛋白是一种优质蛋白质，占蛋清蛋白总量的54%-69%，卵清蛋白是典型的球蛋白，分子量为44.5k Da，属含磷糖蛋白，含有四个自由巯基、385个氨基酸残基。这些氨基酸残基相互缠绕折叠形成具有高度二级结构的球型结构，大部分为α-螺旋和β-折叠。卵清蛋白中心有1个二硫键和4个巯基，当加热时暴露出来，通过分子间相互作用使卵清蛋白胶体结构变得更稳定。

卵清蛋白也叫白蛋白，是含有微量磷的糖蛋白，是一种优质蛋白质，占蛋清蛋白总量的54--69%，是典型号球蛋白。不会被5%饱和硫酸铵溶液沉淀。存在于动物组织、体液、某些了植物的种子当中。分子量较低易溶于水，易结晶。卵清蛋白是动物卵中的一种储存蛋白，可以为发育中的胚胎提供营养物质氨基酸。某些植物种子中的贮藏蛋白，它们是种子萌发的营养来源，也是食物中蛋白质的重要来源。

应用^[4][5]

用于燕窝糖蛋白酶联免疫检测方法的研究

以燕窝中特有成分.燕窝糖蛋白为检测目标,建立了双抗夹心酶联免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测燕窝糖蛋白,为燕窝鉴伪提供有效方法。抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。燕窝经60℃水浴提取、醇析得糖蛋白粗品,再经DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析分离纯化得到了成分相对均一的燕窝特征组分燕窝糖蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量约为60 kD,且为单一条带,再次说明成分相对均一;通过β消去反应,证明O型糖肽键的存在,证明所得组分为糖蛋白。

以纯化的糖蛋白免疫日本大耳白兔,获得了兔抗燕窝糖蛋白抗血清,效价达到64000,采用Protein A-Sepharose 4B亲和层析纯化的抗体作为抗体,其浓度为3.09mg/mL,以常用的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗体得到酶标抗体,经条件优化建立了抗体-抗原-酶标抗体的双抗夹心ELISA方法,其检测限为0.031μg/mL,线性范围为0.0625-2μg/mL。

选用常见的燕窝掺假物银耳、猪皮、淀粉、鸡卵清蛋白以及凝集素、牛血清蛋白(BSA)等常见蛋白类物质进行交叉反应实验,结果抗体和待测物的交叉反应率很低,表明所建立方法特异性强。

采用60℃水浴提取3-4 h,残渣重复提取一次,合并两次提取液,过滤、离心。上清液经PBS缓冲液稀释,稀释液用双抗夹心ELISA法检测并绘制样品稀释曲线,比较稀释曲线和标准曲线,结果表明样品稀释曲线与标准曲线基本平行,说明建立的双抗夹心ELISA方法可以准确地测定燕窝样品提取液。采用建立的燕窝样品糖蛋白检测方法测得白燕样品提取液浓度为558μg/mL。结合交叉反应实验结果,说明该方法可以有效用于燕窝掺假的鉴别。

参考文献

[1]Purification and characterization of a 34-kDa,heat stable glycoprotein from Synadenium grantii latex:action on human fibrinogen and fibrin clot[J].R.Rajesh,A.Nataraju,C.D.R.Gowda,B.M.Frey,F.J.Frey,B.S.Vishwanath.Biochimie.2006(10)

[2]RAPID ENZYME IMMUNOASSAYS FOR THE DETECTION OF CARBARYL AND METHOPRENE IN GRAINS[J].Shuo Wang,Robin D.Allan,Amanda S.Hill,Ivan R.Kennedy.Journal of Environmental Science and Health,Part.2002(6)

[3]Purification and characterization of a glycoprotein inhibitor of toxic phospholipase from Withania somnifera[J].M Deepa,T Veerabasappa Gowda.Archives of Biochemistry and Biophysics.2002(1)

[4]Selection and characterisation of recombinant single-chain antibodies to the hapten Aflatoxin-B1 from naive recombinant antibody libraries[J].Journal of Immunological Methods.2001(1)

[5]崔慧娥.燕窝糖蛋白酶联免疫检测方法的研究[D].天津科技大学,2009.