人D-乳酸脱氢酶(D-LDH) ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人D-乳酸脱氢酶(D-LDH)ELISA KIT用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase）是一类NAD依赖性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三种亚基，可构成6种四聚体同工酶。动物乳酸脱氢酶是由4个亚单位组成的四聚体，常见的A、B两种亚基构成的5种LDH同工酶（LDH1-5），C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4。

乳酸脱氢酶为含锌离子的金属蛋白，分子量为135-140kD，是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α-酮酸。大多数D-乳酸脱氢酶催化是可逆反应，极少数不可逆；对于可逆的D-乳酸脱氢酶来说，只有环境中乳酸浓度较高时才催化逆反应，即催化乳酸合成丙酮酸，来参与细菌的代谢。LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌和骨肌。红细胞内LDH约为正常血清的100倍。D-乳酸脱氢酶(D-LDH)属于D-异构体特异性2-羟酸脱氢酶家族。酵母中的相似蛋白质同时具有D-乳酸和D-甘油酸脱氢酶活性。替代剪接发生在该基因座，并且已经鉴定出编码不同同工型的两个转录物变体。

应用^[4][5]

用于片球菌属乳酸菌乳酸脱氢酶生物合成苯乳酸的研究

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，P.ac）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，P.pe）产PLA的能力，当P.ac和P.pe在MRS培养基上30oC培养36h后PLA分别达到0.65和0.27mmol/L。此外，探究了P.ac产PLA机理，当培养基中添加对应氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）以及酮酸（苯丙酮酸和羟基苯丙酮酸）前体时，PLA和P.ac所产的另一种抑菌物质羟基苯乳酸（OH-4-PLA）产量都得到了极大提高，但是这两种2-羟基酸都会受到非对应前体的抑制。

随着对应和非对应前体添加量增加，促进和抑制作用都会增强，其中酮酸促进对应2-羟基酸产物的作用强于氨基酸，研究表明其原因是由于酮酸是对应2-羟基酸的最直接底物缘故；而氨基酸抑制非对应2-羟基酸作用强于酮酸，其原因是由于P.ac和P.pe发酵产PLA过程中氨基酸竞争共同的酶（氨基转移酶）的底物结合位点，进而抑制后续反应的进行，最终导致PLA合成受限制。乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，D-LDH）是LAB中转化底物苯丙酮酸（Phenypyruvate，PPA）生成PLA的主要酶。

将P.ac和P.pe中可能存在的D-型乳酸脱氢酶（D-1actate dehydrogenase，D-LDH）基因克隆到质粒pET-22b（+）中，并将重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）中，通过诱导表达并纯化出两个重组D-LDH，分别为PaLDH和PpLDH。通过对PaLDH酶学性质研究表明PaLDH在30°C pH5.5时酶活，以PPA和丙酮酸（Pyruvic acid，PA）为底物时酶活分别为140和422.1U/mg，米氏常数Km为2.92mmol/L，转化常数kcat为305s^-1，催化常数kcat/Km为105（mmol/L）^-1s^-1。PpLDH酶学性质研究显示其在45°C pH5.5时酶活，动力学参数分别为Km1.73mmol/L、kcat173s^-1和kcat/Km100（mmol/L）^-1s^-1。

参考文献

[1]Immobilization of flavin adenine dinucleotide(FAD)onto carbon cloth and its application as working electrode in an electroenzymatic bioreactor[J].R.Jayabalan,M.Sathishkumar,E.S.Jeong,S.P.Mun,S.E.Yun.Bioresource Technology.2012

[2]Characterization of d-lactate dehydrogenase from Pediococcus acidilactici that converts phenylpyruvic acid into phenyllactic acid[J].Wanmeng Mu,Shuhuai Yu,Bo Jiang,Xingfeng Li.Biotechnology Letters.2012(5)

[3]Antimicrobial activity of d-3-phenyllactic acid produced by fed-batch process against Salmonella enterica[J].Noelia Rodríguez,JoséManuel Salgado,Sandra Cortés,JoséManuel Domínguez.Food Control.2011(1)

[4]Inhibition of Citrus Fungal Pathogens by Using Lactic Acid Bacteria[J].C.L.Gerez,M.S.Carbajo,G.Rollán,G.Torres Leal,G.Font de Valdez.Journal of Food Science.2010(6)

[5]郁书怀.片球菌属乳酸菌乳酸脱氢酶生物合成苯乳酸的研究[D].江南大学,2013.