人胃泌素细胞抗体(GCA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人胃泌素细胞抗体(GCA)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人胃泌素细胞抗体(GCA)水平。用纯化的人胃泌素细胞抗体(GCA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胃泌素细胞抗体(GCA)，再与HRP标记的胃泌素细胞抗体(GCA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胃泌素细胞抗体(GCA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人胃泌素细胞抗体(GCA)浓度。

胃泌素是一种重要的胃肠激素，它主要由G细胞分泌。G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多，其次是胃底、十二指肠和空肠等处。人胰岛的D细胞亦能分泌胃泌素。人的脑脊液和某些脑组织中存在胃泌素，胃泌素几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能；促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌收缩，整体综合作用是使胃排空减慢；促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖；促进胰岛素和降钙素的释放。

胃泌素还能刺激胃泌酸腺区黏膜和十二指肠黏膜的DNA、RNA和蛋白质合成，从而促进其生长。在临床上能观察到，切除胃窦的病人，血清胃泌素水平下降，同时可发生胃粘膜萎缩；在患有胃泌素瘤的病人，血清胃泌素水平很高，且多伴有胃粘膜的增生、肥厚。

应用^[4][5]

用于抗人胃泌素单克隆抗体及其单链抗体的研制研究

建立能稳定分泌高亲和力、高特异性抗人胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在对其亲和力、特异性以及生物学功能进行鉴定的基础上,克隆抗人胃泌素单克隆抗体的重链和轻链可变区基因,构建抗人胃泌素单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行初步鉴定。

方法:以胃泌素合成肽与钥孔戚血蓝蛋白的偶联物为免疫原,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗人胃泌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,大量制备并经盐析、蛋白G亲和层析获得纯化的单克隆抗体,采用SDS-PAGE对抗体进行分子量和纯度鉴定,间接ELISA法检测效价,双向琼脂扩散实验鉴定类和亚类,非竞争酶免疫实验测定亲和力,斑点ELISA和免疫组化鉴定特异性,并且分别采用荧光染色法和MTT比色法,研究其对胃泌素/胃泌素受体结合的阻断作用,以及对SGC-7901细胞增殖的抑制作用。

在此基础上,选择杂交瘤细胞株E8,用TRIZOL试剂提取总RNA,通过RT-PCR,采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物,扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来,构建单链抗体基因,克隆到pGEM-T载体中,通过酶切、PCR和测序进行鉴定。然后用限制性内切酶双酶切pGEM-gastrin-ScFv质粒和pET-28a(+)质粒,构建pET-gastrin-ScFv重组表达质粒。

参考文献

[1]Gastrin as an autocrine growth factor in colorectal carcinoma:implications for therapy.Baldwin GS,Shulkes A.World J Gastroenterol.1998

[2]Trafficking of CCK-B/gastrin receptor in tumor cells using confocal microscopy.Savage K,Khan K,Dhillon AP,et al.Gastroenterology.1999

[3]Effect of gastrin on protein kinase C and its subtype in human colon cancer cell line SW480.Xie B,He SW,Wang XD.World Journal of Gastroenterology.2000

[4]Expression of gastrin in hepatocellular carcinoma,fibrolamellar carcinoma and cholangiocarcinoma.Caplin ME,Khan K,Savage K,Rode J,Varro A,Micheali D,Grimes.Journal of Hepatology.1999

[5]王霞.抗人胃泌素单克隆抗体及其单链抗体的研制[D].四川大学,2004.