小鼠QA淋巴细胞抗原2(QA-2)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠QA淋巴细胞抗原2(QA-2)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中小鼠Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)水平。用纯化的小鼠Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)，再与HRP标记的Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠Qa淋巴细胞抗原2(Qa-2)浓度。

操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于Qa-2参与脐带间充质干细胞移植治疗小鼠AIH中的免疫调控研究

UC-MSCs可抑制活化T细胞体外增殖，调节IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的分泌，并呈数量依赖性。结论：采用双酶消化法可以成功分离、培养出孕鼠UC-MSCs；UC-MSCs在体外具有抑制T细胞增殖的作用，调节炎症因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的分泌。二、Qa-2参与脐带间充质干细胞抑制活化T淋巴细胞增殖的免疫调控目的：探讨UC-MSCs对T淋巴细胞的增殖产生抑制效应的同时，其分泌Qa-2蛋白对T淋巴细胞内TC-PTP和Lck信号分子的免疫调控效应。方法：CFSE和DAPI染料对UC-MSCs和T淋巴细胞体外染色。采用ELISA法、流式细胞术及RT-PCR、Western-blot分析UC-MSCs表达的H2-Q7基因和Qa-2蛋白，以及在MLR体系中不同时间点H2-Q7基因和Qa-2蛋白变化。Qa-2单克隆抗体对UC-MSCs抑制活化T淋巴细胞增殖中的阻断作用及阻断作用对培养体系中细胞因子IFN-γ和IL-10水平的影响。RT-PCR、Western-blot法检测不同培养代数UC-MSCs中H2-Q7基因和Qa-2蛋白的变化情况。ELISA法检测rmIFN-γ干预后培养基上清液中Qa-2蛋白的分泌水平。结果：（1）UC-MSCs经CFSE和DAPI染色后，胞浆为绿色，胞核为蓝色，界限清晰。

参考文献

[1]Mesenchymal stem cells for treatment of acute and chronic graft-versus-host disease,tissue toxicity and hemorrhages[J].O.Ringden,K.Le Blanc.Best Practice&Research Clinical Haematology.2011(1)

[2]Human Bone Marrow–Derived Clonal Mesenchymal Stem Cells Inhibit Inflammation and Reduce Acute Pancreatitis in Rats[J].Kyung Hee Jung,Sun U.Song,Tacghee Yi,Myung–Shin Jeon,Sang–Won Hong,Hong–Mei Zheng,Hee–Seung Lee,Myung–Joo Choi,Don–Haeng Lee,Soon–Sun Hong.Gastroenterology.2011(3)

[3]HLA-G Level on Monocytoid Dendritic Cells Correlates With Regulatory T-Cell Foxp3 Expression in Liver Transplant Tolerance[J].Antonino Castellaneta,George V.Mazariegos,Navdeep Nayyar,Adriana Zeevi,Angus W.Thomson.Transplantation.2011(10)

[4]Concise Review:Mesenchymal Stem Cell Treatment of the Complications of Diabetes Mellitus[J].VladislavVolarevic,NebojsaArsenijevic,Miodrag L.Lukic,MiodragStojkovic.STEM CELLS.2011(1)

[5]吕胜祥.Qa-2参与脐带间充质干细胞移植治疗小鼠AIH中的免疫调控研究[D].苏州大学,2012.