通用型DNA纯化回收试剂盒

概述^[1]

通用型DNA纯化回收试剂盒采用独特的缓冲体系和离心吸附柱，既可从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA片段，又可用于直接纯化PCR产物，能够满足多种实验需要。溶胶液PC中含有pH指示剂，可根据颜色来判断溶胶状态。使用本产品可回收100 bp-8 kb大小的DNA片段，回收率可达80%。使用本试剂盒回收的DNA可直接用于连接、转化、酶切、测序等分子生物学实验。

产品特点

1.兼容性强：既可用作DNA产物直接纯化，又可用作DNA凝胶回收。

2.操作简便、可回收胶体积大：可按照胶块与溶胶液等比进行溶胶。

3.稳定、可靠：配有指示剂，可直观判断影响DNA吸附的pH值，又可保证DNA与膜充分结合，提高回收效率。

试剂盒组成^[1]

保存条件：室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。

注意事项^[1]

1．平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。使用前请先检查平衡液BL是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

2．溶液PC含有pH指示剂，为黄色，指示pH≤7.5。

操作步骤^[1]

使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

一、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

3．向胶块中加入等倍体积溶液PC（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100 μl，则加入100 μl PC溶液），50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。

注意：对于回收<150 bp的小片段可将溶液PC的体积增加到3倍以提高回收率；胶块完全溶解后将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。凝胶完全融解后应呈现黄色，即可进行后续操作。如果胶完全融解后溶液的颜色为桔红色或紫色，请使用10 μl 3M乙酸钠（pH 5.0）将溶液的颜色调为黄色后再进行后续操作。（溶液PC中含有pH指示剂，当pH≤7.5时溶液的颜色为黄色，此时DNA才能够有效的与膜结合，当pH值偏高时溶液的颜色变为桔红色和紫色，需要进行调整。）

4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5．向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5 min再离心。

6．重复操作步骤5

7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm （~13400×g )离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

8．将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，（如果回收的目的片段>4 kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热），室温放置2 min。12000rpm （~13400×g )离心2 min，收集DNA溶液。

注意：洗脱液的体积不应少于30 μl，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。

二、从PCR反应液或酶切反应液中回收DNA

1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2．估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液PC，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。

注意：对于回收<150 bp的小片段可将溶液PC的体积增加到3倍以提高回收率；溶液混匀后应呈现黄色，即可进行后续操作。如果溶液的颜色为桔红色或紫色，请使用10 μl 3M乙酸钠（pH 5.0）将溶液的颜色调为黄色后再进行后续操作。

3．将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放2 min，12000rpm （~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。

4．向吸附柱CB2中加入600 μl漂洗液PW （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

注意：如果纯化的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5 min再离心。

5．重复操作步骤4.

6．将吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm （~13400×g )离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

7．将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，（如果回收的目的片段>4 kb，则洗脱缓冲液EB应置于65-70℃水浴预热），室温放置2 min。12000rpm （~13400×g )离心2 min收集DNA溶液。

注意：洗脱液的体积不应少于30 μl，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有较大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12000rpm（~13400×g)离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。

主要参考资料

[1] 通用型DNA纯化回收试剂盒产品说明书