酵母高纯质粒小量快速提取试剂盒

概述^[1]

酵母高纯质粒小量快速提取试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lytic Enzyme特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除细胞壁后，然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

储存事项^[1]

1.次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100µg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。

2.环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3. Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

关于平衡液的使用^[1]

1.介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

2.使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

注意事项^[1]

1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.溶液YP3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3.通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计都很难检测到。提取的质粒如果用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择商业化的高效率的感受态细胞。

4.用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，28 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在600 ml 去离子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。

5.菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。

6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

主要参考资料

[1] 酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒产品说明书