病毒RNA提取试剂盒

概述^[1]

本试剂盒专用于从血清(血浆)等液体样品中提取病毒 RNA。本产品回收率极高，尤其适合于整合到临床 RT-PCR 检测试剂盒中。且能用于提取其他液体样品和微量样品。本产品具有以下特点：

1. 回收率高，可以达到90%以上，高于绝大部分基于离心柱的提取方法。

2. 灵敏度高，通过PCR检测到的最终灵敏度可以达到50~100拷贝/ml。

3. 一管式操作，不使用离心柱，整个操作过程均在室温下完成。

4. 安全无毒，不需要使用苯酚和氯仿等有机溶液。

5. 处理量大，如果加上病毒离心富集步骤，最多可以处理1.5 ml液体病毒样品。

保存方法^[1]

常温运输，4℃保存。

试剂准备^[1]

1. 自备材料：小型高速离心机、离心管、异丙醇、70%乙醇等。

2. 血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用EDTA低15%左右。

3. 用于制备血浆的全血在2~25°C放置的时间不能超过6小时，在此时间内，可以室温800-1600 g离心20分钟，上清即为血浆。血浆可以在2~8°C或更低温度下运输，可以在室温放置一天，2~8°C放置5天，-20°C以下长期保存。血浆按0.6mL/管的量分装保存，以避免反复冻融。 

标准抽提步骤^[1]

1. 每管（包括正负对照管）中加入0.6 ml Buffer Rlysis-VG溶液（需提前融化）。

为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。注意设置阳性和阴性对照。

2. 快速震荡样品几秒，再短暂离心，取0.2 ml液体样品加入到已经装有0.6 ml Buffer Rlysis-VG溶液的离心管中。如果病毒需要富集，可以将1.5 ml液体样品在4℃ 24,000 g冷冻离心60 min，移弃1.3 ml上清后作为样品。

3. 在正负对照样品管中分别加正负对照样品。

4. 室温放置10分钟。此间可以在每个管上做个标记，以在下步区别向心面和离心面。

5. 振荡数秒后加入0.7 ml异丙醇，旋紧盖后振荡30 sec混匀，把离心管的向心面对向转头的中央，13,000~15,000 g室温离

心至少15 min。

6. 小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀。此时可能看不见 RNA 沉淀。

7. 加入1.0 ml 70%乙醇，振荡数秒后15,000 g室温离心5 min。在离心机中放置离心管时将其向心面对向转头的中央。

8. 小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀。此时 RNA 呈膜状沉淀。

9. 再短暂离心数秒, 用移液器移弃残留液体（70%乙醇），否则它会影响后续反应。

10. 加入200 μl Rnase-free水，用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁离心面的膜状RNA沉淀，溶液将呈混浊状，含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有 RNA，所以不要离心后取上清使用，必须取混合液使用，哪怕很浑浊。

11. 样品可以直接取适量用于RT-PCR，也可保存于-70°C长期保存。

如果溶于 200 μl 水，同时样品使用量不超过 RT-PCR 体系的 1/2，不溶物一般不会影响 RT-PCR。剩余样品可以室温放置 2 小时，也可保存于-80°C 保存一个月。

主要参考资料

[1] 病毒 RNA 抽提纯化试剂盒产品说明书