醋酸特立帕肽的应用、制备、作用机制

背景及概述^[1][2]

特立帕肽是一种合成的34肽，为人甲状旁腺素PTH的1-34氨基酸片段，该片段是含有84个氨基酸的内源性甲状旁腺素PTH具有生物活性的N-末端区域。本品的免疫学和生物学特性与内源性甲状旁腺素PTH以及牛甲状旁腺素PTH(bPTH)完全相同。

醋酸特立帕肽是种获得美国食品及药物管理局FDA批准的骨形成剂类新药，这种甲状旁腺激素的衍生物可以通过增加成骨细胞的活性及数量而促进骨生长，而目前的常规骨质疏松药物一般只是作用于破骨细胞而减缓或阻断骨质流失，醋酸特立帕肽是由礼来药厂生产的，涉及到1637例绝经后骨质疏松症患者的临床研究结果显示，与那些只服用了钙和维生素D补加剂的患者相比，96％的患者在接受该药治疗后，其脊柱和臀部的骨(矿物质)密度BMD均表现出显著增加，此外还发现，该药能够分别减少发生脊柱骨折和其他类型骨折危险的65％和53％。对于本品制备的方法，已有专利技术进行公开。中国专利公开了以2-氯三苯甲基氯树脂(2-CTC树脂)为固相载体风味5个片段进行偶联，虽然该方法可以缩短合成周期，但是其总收率最高仅为32.2％。

制备^[2]

醋酸特立帕肽制备如下：

步骤1：肽树脂1的合成

将200g取代值为0.65mmol/g的HMPLinkerAmide树脂，加入到固相反应柱中，加入DMF溶胀树脂30分钟后抽干。取100.6gFmoc-Phe-OH和35.1gHOBt，用DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入35mLDIC和3.2gDMAP，室温搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，甲醇洗涤3次，每次洗涤时间为3min，得到Fmoc-Phe-HMPLinkerAmide树脂，取代值为0.50mmol/g。

步骤2：特立帕肽肽树脂的合成

取0.1mol步骤1的Fmoc-Phe-HMPLinkerAmide树脂(取代值为0.50mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Phe-HMPLinkerAmide树脂。取0.3molFmoc-Asn(Trt)和0.3molHOBt，用适量DMF溶解；另取0.3molDIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Phe-HMPLinkerAmide树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Asn(Trt)-Phe-HMPLinkerAmide树脂。同上法依次接入下表保护氨基酸或片段，得到特立帕肽肽树脂：

H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-HMPLinkerAmide树脂

步骤3：特立帕肽粗品的制备

取0.05mol步骤2制得的特立帕肽肽树脂，加入体积百分比为90％的TFA、体积百分比为5％的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克特立帕肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为特立帕肽粗品，粗品纯度为85.7％。

步骤4：特立帕肽粗品纯化

取步骤3所得特立帕肽粗品，加水搅拌溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽纯化中间体浓缩液；取特立帕肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到醋酸特立帕肽水溶液，冷冻干燥，得特立帕肽纯品98.8g，总收率为47.3％，分子量：4178.8(100％M+H)，纯度：99.4％，单一杂质0.11％。      

作用机制^[3]

甲状旁腺激素(parathyroidhormone，PTH)是调节血液中钙磷代谢的主要激素，由甲状旁腺主细胞分泌，是一种由84个氨基酸组成的多肽，其结构不含半胱氨酸，可与PTH受体结合，对骨代谢发挥双向作用。PTH受体属于G蛋白偶联受体超家族，受体分为Ⅰ型和Ⅱ型。PTH-Ⅰ受体主要分布于骨骼及肾，PTH-Ⅱ受体分布于脑和胰腺。N端肽链与PTH-Ⅰ受体结合发挥促进骨细胞生长的作用；而C端肽链与PTH-Ⅱ受体结合，可发挥促进骨细胞凋亡的作用。特立帕肽是PTH的活性片段(PTH1-34，C181H291N55O51S2)，分子量为4117.8U，是目前唯一可以促进骨合成代谢的药物。该药物由美国礼来公司通过生物合成技术，以大肠埃希菌为宿主研发的一种甲状旁腺激素的衍生物。其34个氨基酸序列与人体PTH的N端氨基酸序列一致，保持了PTH完整的生物活性。与天然PTH相比，保存了与PTH-Ⅰ受体结合调节成骨细胞的作用，同时也消除了PTH的C端所带来的促进骨凋亡作用。2002年12月美国FDA批准其上市，用于绝经后女性和男性骨质疏松的治疗，推荐剂量为20μg/d。皮下注射本品20μg，达峰时间30min，半衰期为60min，3h内即可降至不可测水平。静脉注射血清半衰期为5min，生物利用度为95%，90%药物经肾清除。特立帕肽可通过抑制成骨细胞凋亡、激活骨衬细胞和增强成骨细胞分化来介导骨代谢。通过调节腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷-蛋白激酶A传导通路间歇性刺激成骨细胞、骨衬细胞和骨髓基质干细胞表面PHT-Ⅰ受体，促进成骨细胞的分化、延长成骨细胞寿命；通过磷酸酯C-胞浆钙离子-蛋白激酶C信号传导通路，刺激成骨细胞系增殖；通过抑制PPARγ的反式激活活性，减少基质细胞向脂肪细胞系分化，使成骨细胞数量增加；通过调节细胞因子间接调节骨的成长，例如可以诱导iGF-1与成骨细胞结合，从而促进骨的形成；通过Wnt信号通路调节骨形成的过程，从而增加骨的形成。

应用^[3]

特立帕肽可以促进骨形成、提高骨密度、降低骨折风险，其在骨质疏松性骨折的治疗中有着独特的作用和优势。动物实验研究已证实，特立帕肽可以加速骨与外侧骨皮质的形成，促进大鼠股骨骨折愈合。对去卵巢大鼠(3个月)行胫骨双侧干骺端截骨术，建立骨质疏松性骨折模型，并间歇性小剂量给予特立帕肽，发现特立帕肽可以促进骨折愈合且无任何全身性不良反应；该作者采用去卵巢大鼠(8个月)及假手术雄性大鼠进行相同实验，发现特立帕肽可以增加大鼠肌肉的毛细血管密度，促进骨折愈合，并且无全身不良反应。

对80只小鼠进行截骨术和胫骨髓内钉固定以探究特立帕肽促进骨折愈合的作用与骨折部位机械负荷之间的关系，发现特立帕肽在负重的条件下促进骨折愈合的效果更好；研究发现，即使在机械负荷降低的情况下，特立帕肽也可以促进骨折愈合。通过定量计算机断层扫描(QCT)和计算机断层扫描成像技术(HR-PQCT)分析发现，特立帕肽与唑来膦酸对去势大鼠骨折愈合具有累加效应，可显著增加去势大鼠骨小梁密度和皮质厚度，促进骨痂形成。临床试验方面，通过系统回顾发现，对于伴有骨质疏松性骨折患者特立帕肽不但能够治疗骨质疏松也可能促进骨折的愈合。为探究特立帕肽对骨质疏松性骨折的愈合作用，以桡骨远端骨折的绝经期后女性为研究对象进行了前瞻性随机双盲对照试验。试验共纳入102名患者，随机分为3组，分别给予安慰剂、40μg特立帕肽、20μg特立帕肽，治疗时间共计8周，随访期限为44周。研究发现，特立帕肽组愈合速度明显快于安慰剂组，且20μg组愈合最快，40μg组无剂量优势。

以耻骨或耻骨联合骨折的绝经期后女性为研究对象，进行了随机双盲对照试验，共纳入65名患者，随机分为2组，一组应用rhPTH1-84，另一组用安慰剂作为对照。试验组骨折愈合时间明显短于对照组，试验第8周进行视觉模拟疼痛评分发现，试验组疼痛程度明显低于对照组；第12周时，试验组功能较对照明显改善。除此之外，有多项病例报道提示特立帕肽可能逆转骨折延迟愈合甚至不愈合，包括绝经后女性股骨远端干骺端骨折不愈合、膝关节置换术后假体周围骨折不愈合、跖骨应力性骨折、胸骨骨折不愈合、萎缩性肱骨不连、髋关节骨折、低磷酸酯酶症导致的股骨近端假性骨折和跖骨应力性骨折以及骨质疏松症患者长期应用双磷酸盐类药物导致的股骨非典型骨折。这些患者使用特立帕肽的疗程为2个月~2年。其中2例在骨折发生2周内即开始使用甲状旁腺激素进行治疗，其他患者在骨折延迟愈合或不愈合后，采用特立帕肽进行治疗，治疗后1~3个月，可见骨不连处骨痂形成；治疗后5~21个月，骨折部位完全愈合。大量的研究显示，特立帕肽在各适应证人群中具有良好的疗效和安全性。特立帕肽的不良反应多表现为疼痛、呕吐、眩晕、高血钙及高尿钙。虽有动物研究发现大剂量特立帕肽可增加大鼠骨肉瘤的发生率，但在临床研究中未得到证实。

主要参考资料

[1] CN201810119038.9一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法

[2] CN201510295556.2一种合成特立帕肽的方法

[3] 特立帕肽治疗骨质疏松性骨折的研究进展