人脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）的试剂盒。往预先包被人脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PL-A2）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PL-A2）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算人脂蛋白磷脂酶A2(LP-PL-A2)样品浓度。

脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一种与低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、动脉粥样硬化疾病和心血管疾病相关的新型炎症标志物。动脉粥样硬化和动脉粥样硬化形成是与心肌梗塞、中风和其他闭塞性血管相关疾病的潜在罪魁祸首，其被视为炎症性疾病。研究发现，引发动脉粥样硬化炎症发生的途径可能有三种：一，被氧化的LDL具有细胞毒性，能够引起动脉细胞损伤和招募特异性炎症性T细胞向动脉壁迁移；二，被氧化的LDL可能通过与巨噬细胞Toll-like受体相互作用直接激活炎症；三，通过释放生物活性代谢物，Lp-PLA2水解LDL中的氧化磷脂产生两个炎性分子——氧化的非酯化脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）。

应用^[4][5]

用于LP-PLA2的原核表达、抗体制备及表位分析

脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein–associated phospholipase A2,LP-PLA2)属于VIIA型磷脂酶A2,它可以预测与冠脉事件有关的动脉粥样硬化和中风危险。获取人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白,制备相应抗体,同时验证经生物信息学预测的表位肽的抗原性,为LP-PLA2体外免疫诊断试剂的研发奠定基础。方法采用Trizol法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段LP-PLA2;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行多步骤纯化并除去标签,获得目的蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗LP-PLA2的多克隆抗体;运用多种生物信息学方法对LP-PLA2抗原表位进行预测,并用纯化的LP-PLA2多克隆抗体鉴定其抗原性。

结果:

1.成功构建了PET-28a(+)-LP-PLA2,PGEX-4T-2-LP-PLA2,pCold TF-LP-PLA2等重组表达质粒。

2.经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:LP-PLA2在PET-28a(+)-LP-PLA2表达载体中不表达;在PGEX-4T-2-LP-PLA2表达载体中少量表达,且主要以包涵体形式存在;在pCold TF-LP-PLA2表达载体中,获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。

3.将pCold TF-LP-PLA2诱导表达上清经镍柱亲和层析纯化后,获得TF-LP-PLA2重组蛋白,将该重组蛋白用HRV-3C prolease酶切后,用蓝胶分离纯化,获得了纯度约为90%、分子量约为45kD的蛋白,与预期相符,且该蛋白能够被市售的LP-PLA2多克隆抗体识别,证明获得了纯度较高的LP-PLA2目的蛋白。

4.制备了抗LP-PLA2的多克隆抗体,抗体效价>1:5.12×106,Western blot结果表明,该抗体特异性较高。

参考文献

[1]Trigger factor lacking the PPIase domain can enhance the folding of eukaryotic multi-domain proteins in Escherichia coli[J].Rashmi Gupta,Sathish Kumar Lakshmipathy,Hung-Chun Chang,Stephanie A.Etchells,F.Ulrich Hartl.FEBS Letters.2010(16)

[2]Lp-PLA 2 as a Marker of Cardiovascular Diseases[J].Sabha Bhatti,Abdul Hakeem,Mehmet Cilingiroglu.Current Atherosclerosis Reports.2010(2)

[3]Lp-PLA 2:A New Target for Statin Therapy[J].Lynne T.Braun,Michael H.Davidson.Current Atherosclerosis Reports.2010(1)

[4]Τhe role of lipoprotein-associated phospholipase A 2 in atherosclerosis may depend on its lipoprotein carrier in plasma[J].Constantinos C.Tellis,Alexandros D.Tselepis.BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids.2009(5)

[5]黄美容.LP-PLA2的原核表达、抗体制备及表位分析[D].重庆医科大学,2011.