Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit,Without Controls的应用

背景^[1-4]

Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit,Without Controls（染色质免疫共沉淀试剂盒）适用于特异性定性免疫沉淀和定量PCR，MS-PCR，DNA测序和Southern blot DNA微阵列检测。

Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit供了化的缓冲液和试剂配方，利用染色质免疫共沉淀的方法来从染色质中选择性地富集含有特殊DNA序列的染色质片段，以此来研究细胞中蛋白质-DNA的相互作用.Imprint Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit提供了对细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且试剂盒中含有一种阳性对照抗体(RNA聚合酶II抗体)、一种阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作为阳性对照来保证试剂盒中试剂和操作步骤没出现问题)。

在大多数生长期的哺乳动物细胞中，RNA聚合酶II会在GAPDH基因启动子上富集，准备起始转录，因此该启动子能与RNA聚合酶II发生免疫沉淀反应，而不能与正常小鼠IgG发生。在本染色质免疫沉淀反应中，细胞耦合了甲醛，提取出其中的染色质。染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过专门设计的高速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可用于随后的各种分析。

应用^[5][6]

用于染色质免疫共沉淀技术解析转录调控蛋白Hac1在蛋白分泌调控中的功能研究

丝状真菌转录调控蛋白Hac1是未折叠蛋白响应途径的重要调控蛋白,可介导蛋白分泌合成系统中分子伴侣BIP1、二硫键异构酶PDI1等相关基因表达量的上调,从而对胞外蛋白的分泌产生重要影响。因此深入挖掘蛋白合成分泌系统中受Hac1调控的基因,解析其功能,有助于阐明丝状真菌的高效蛋白分泌机制以及为进一步通过遗传改造提高菌株的蛋白分泌能力提供靶标。

以斜卧青霉114-2为材料,对菌株未折叠蛋白响应(UPR)途径中的转录调控蛋白Hac1功能开展研究。通过测定胞外蛋白浓度并结合实时荧光定量PCR检测UPR响应代表性基因bipA、pdiA的相对表达量,监测UPR的响应情况,从而确定染色质免疫共沉淀分析的时间点。通过对菌丝交联时间及超声波破碎条件的探索,建立斜卧青霉染色质免疫共沉淀关键步骤超声波破碎方法。利用染色质免疫共沉淀及RAPD-测序技术筛选出Hac1直接调控的靶基因,并对其靶标基因3379功能进行分析。利用融合PCR和巢式PCR构建3379敲除盒,原生质体转化菌株敲除3379基因。通过对敲除菌株的表型观察及蛋白、酶活测定,初步鉴定靶基因3379的功能。

参考文献

[1]DBD2BS:connecting a DNA-binding protein with its binding sites[J].Ting-Ying Chien,Chih-Kang Lin,Chih-Wei Lin,Yi-Zhong Weng,Chien-Yu Chen,Darby Tien-Hao Chang.Nucleic Acids Research.2012(W1)

[2]Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci[J].Cell.2009(1)

[3]Autophagy in filamentous fungi[J].Judith K.Pollack,Steven D.Harris,Mark R.Marten.Fungal Genetics and Biology.2008(1)

[4]Histone modifications and dynamic regulation of genome accessibility in plants[J].Jennifer Pfluger,Doris Wagner.Current Opinion in Plant Biology.2007(6)

[5]Systematic analysis of SNARE localization in the filamentous fungus Aspergillus oryzae[J].Masahiro Kuratsu,Ayako Taura,Jun-ya Shoji,Satoko Kikuchi,Manabu Arioka,Katsuhiko Kitamoto.Fungal Genetics and Biology.2007(12)

[6]房艳华.染色质免疫共沉淀技术解析转录调控蛋白Hac1在蛋白分泌调控中的功能[D].西北农林科技大学,2017.