生物素标记的人IGG的应用

背景^[1-3]

生物素标记的人IGG是经亲和层析纯化成高纯度IgG成分，将活化生物素（羟基琥珀酰亚胺酯，BNHS）共价交联到抗体IgG分子上制成。生物素化人IgG标记的样品可应用酶标或荧光染料标记的亲和素或生物素-亲和素复合物来检测。生物素又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族，B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质,是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。

生物素可以用作核酸探针的标记物，它能与核酸分子的UTP或dUTP 5‘位上的C相结合，并可与亲和素结合而被检测。在检测的过程中，生物素只用作固定连接，而不用作信号检测。抗体的产生是对外来分子侵入体内的一种响应。抗体以一个或多个由四条多肽链组成的Y形单体存在。每个Y形单体包含两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链的序列和长度不同。Y形单体的顶部包含可变区，该区可与抗原上的表位特异性紧密结合。

IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75%。其中40～50%分布于血清中，其余分布在组织中。IgG是唯一可以通过胎盘的免疫球蛋白。IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒；应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。其指标对于诊断某些疾病具有意义。

应用^[4][5]

用于基于生物素—亲和素系统引入的蛋白质芯片研究

选用的自组装试剂是11-巯基十一烷酸（MUA）,分子式为HS-（CH2）10-COOH,其一端的巯基（-SH）可以和Au发生化学吸附,形成的S-Au键键能约177kJ/mol,这种强的键合作用使得巯基化合物在金表面吸附有明显的优越性,另一端的羧基（-COOH）则暴露在基片的表面。另外从分子式还可以看出它是一个具有11个碳原子的长链有机分子,它一端的巯基与Au结合,另一端则可以与待测蛋白质分子共价结合,这样一来待测蛋白质分子与基体表面就有11个碳原子的距离,很好的保持了待测蛋白质分子原来的空间构象,从而也就降低了检测的假阴性率,提高了检测的准确性。自组装之后,由于基片表面的羧基不能直接与人IgG上的氨基（-NH2）反应,需首先将羧基活化,使它变为活泼酯,进而才可以与氨基反应。

在蛋白质芯片上引入生物素-亲和素系统,它是以生物素-亲和素之间具有很高的结合能力为基础,二者还可以偶联抗原、抗体、酶、荧光素等大分子生物活性物质,它们的结合迅速、专一、稳定。其中亲合素是由4个相同的亚单位构成的四聚体,每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的咪唑酮环结合。这样1个亲合素分子具有4个与生物素分子结合的位点,使其具有放大效应。亲合素与生物素之间的亲和力极强,二者的亲和系数（Ka）为1015mol-1,比抗原与抗体的亲和力(Ka=10511mol-1)至少高104倍,所以能高速结合,而且反应不受外界干扰,具有高度特异性和稳定性。免疫学实验部分是本文的重要内容,实验中用到了酶标仪,荧光扫描仪等仪器,主要内容分为两大部分:一是以酶作为标记的在96孔板上做的微孔板ELISA实验;二是以荧光分子作为标记的在自制基片上做的微阵列实验,每种实验又分为常规实验和加了生物素-亲和素的实验。

参考文献

[1]Selective adsorption of alkyl thiols on gold in different geometries[J].Philipp Schapotschnikow,RenéPool,Thijs J.H.Vlugt.Computer Physics Communications.2007(1)

[2]Diagnosis of congenital disorders of glycosylation type‐I using protein chip technology[J].KevinMills,PhilippaMills,MarieJackson,VikiWorthington,ClareBeesley,AnúskaMann,PeterClayton,StephanieGrunewald,GeoffreyKeir,LizYoung,JamesLangridge,NasiMian,BryanWinchester.Proteomics.2006(7)

[3]Protein microarrays as tools for functional proteomics[J].Joshua LaBaer,Niroshan Ramachandran.Current Opinion in Chemical Biology.2005(1)

[4]Next generation of protein microarray support materials:[J].Journal of Chromatography A.2003(1)

[5]崔浩巍.基于生物素—亲和素系统引入的蛋白质芯片研究[D].华中科技大学,2010.