ROSETTA(DE3)感受态细胞的应用

背景^[1]

ROSETTA(DE3)感受态细胞具有氯霉素抗性，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。Rosetta(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/μg DNA。Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。

Rosetta(DE3)菌株含有pRARE质粒，能够提供AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA稀有密码子的tRNA，该质粒具有氯霉素抗性。

Rosetta(DE3)载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。

DE3是溶源性的λDE3,所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。

菌株特点^[2]

Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。

Rosetta(DE3)pLySs来源于Rosetta(DE3)，菌株含有pRARE质粒，能够提供AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA稀有密码子的tRNA，该质粒具有氯霉素抗性。

Rosetta(DE3)pLySs载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。

DE3是溶源性的λDE3,所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。

含有pLSs质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。pLySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pLySs质粒的起始复制位点是p15 Origin,这使得该质粒能够和pUC-及pBR322-衍生的质粒互相共存。

应用^[3]

用于5’端突变人干扰素-α2b基因在大肠杆菌BL21中的高效表达研究

定点突变人干扰素-α2b(hIFN-α2b)基因的5’端序列,构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核高表达载体pJW2-rhIFN-α2b’,转化至大肠杆菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞,分析不同宿主菌对其表达量的影响,经SDS-PAGE,Western blot鉴定获得重组人干扰素-α2b的高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b’/BL21。方法依据大肠杆菌密码子偏好性,在不改变hIFN-α2b的氨基酸序列的情况下,定点突变hIFN-α2b基因5’端序列并PCR扩增出rhIFN-α2b’,克隆至pUC19,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝-白斑筛选及测序验证正确,将rhIFN-α2b’克隆至温控型表达载体pJW2,NdeⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR验证正确后,分别将pJW2-rhIFN-α2b和pJW2-rhIFN-α2b’转化至大肠杆菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)感受态细胞,30℃过夜培养,42℃温度诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析宿主菌DH5α,BL21,Rosetta-gami B(DE3)对目的蛋白表达的影响进而选择大肠杆菌BL21为其宿主菌;挑取pJW2-rhIFN-α2b’/BL21单菌落,30℃过夜培养,42℃温度诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE,Western blot鉴定分析并以WISH细胞-VSV病毒系统的细胞病变抑制法(CPE)测定表达蛋白的抗病毒活性及其效价。

结果NdeⅠ/BamHⅠ双酶切、PCR验证及测序结果证实pJW2-rhIFN-α2b’构建成功;SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b’(BL21)比pJW2-rhIFN-α2b’(DH5α),pJW2-rhIFN-α2b’(Rosetta-gami B(DE3))的hIFN-α2b表达量高;SDS-PAGE分析表明pJW2-rhIFN-α2b’/BL21表达的rhIFN-α2b约占菌体总蛋白23.6%,Western blot表明rhIFN-α2b具有与hIFN-α2b相同的免疫原性,纯化的rhIFN-α2b经WISH细胞-VSV病毒系统证实其比活性达1.2×108 IU/mg。结论成功构建出5’端突变的rhIFN-α2b原核高表达工程菌pJW2-rhIFN-α2b’(BL21),可提高其在大肠杆菌中的表达水平。

参考文献

[1] 钮利喜. 工程菌生物转化D-氨基酸及其相关酶的研究[D].山西大学,2007.

[2] 熊火梅. 人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备[D].南昌大学,2011.

[3] 王参军. 5'端突变人干扰素-α2b基因在大肠杆菌BL21中的高效表达[D].安徽医科大学,2010.