醋酸布舍瑞林的制备

概述^[1][3]

醋酸布舍瑞林（Buserelin）是一种水溶性多肽类药物，为下丘脑分泌的天然促性腺激素释放激素（GnRH/LHRH）类似物，可促进黄体生成激素LH、促卵胞生成激素FSH和性激素分泌增加，药理效应为LHRH的20-170倍，长期给予醋酸布舍瑞林可以抑制绒促性素的生成，并抑制卵巢和睾丸类固醇的生成。醋酸布舍瑞林的主要临床应用包括姑息治疗激素依赖的前列腺癌（D期）、乳腺癌、无需手术治疗的子宫内膜异位症等疾病的治疗。

制备^[2]

醋酸布舍瑞林结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBU)-Leu-Arg-Pro-NH-Et，现有的合成醋酸布舍瑞林的方法主要有两种：

种是片段缩合法，即将醋酸布舍瑞林拆分成几个片段（如两个）分别合成，所合成的各个裸肽片段在液相条件下进行偶联，如CN101735308A公开的4+5片段合成方法，先合成五片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四片段D-Ser(tBU)-Leu-Arg-Pro-NHEt，然后缩合得到醋酸布舍瑞林。这种片段缩合方法的缺陷非常明显，工艺操作繁琐；更重要的是，片段偶联过程中，多肽发生消旋反应的现象比较严重；另外且最终收率较低。

第二种是全序列部分保护合成方法，即在固相合成过程中，对部分氨基酸侧链进行保护，并最终在液相中实现乙氨基化，此工艺虽然实现在固相载体上的全序列合成，但是由于采用的是部分保护，所以合成过程中引入的杂质较多，出产品的质量很差，纯化过程中较难分离，很难得到高质量的产品，且综合收率不高。

CN101935339A公开了一种全保护合成醋酸布舍瑞林的方法，固相合成醋酸布舍瑞林后，裂解去除树脂，然后将全保护肽经过乙氨基化、裂解脱除保护基的步骤得到醋酸布舍瑞林，该方法无论是乙氨基化过程，在冰水浴条件下进行，不适于工业化操作。WO2008/044890公开了一种合成醋酸布舍瑞林的方法，分别合成Pro-NH-Et和Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBU)-Leu-Arg-OH，然后偶联、去除保护基获得醋酸布舍瑞林；该方法先通过氨基酸偶联获得肽链，之后先脱除树脂，然后再偶联氨基酸Pro-NH-Et，实际操作过程中，工艺变化非常繁琐。

具体方法：

参照图1，本实施例固相合成醋酸布舍瑞林的方法如下：

步骤1，乙胺基CTC树脂的制备，合成路线如下：

CTC（I-1）树脂在二氯甲烷（DCM，20ml DCM/g CTC树脂）中溶胀3h以上，然后用质量浓度1%的TEA的DCM溶液洗涤。

氨基钠、DCM按照1∶3重量比缓缓加入到置有溶胀CTC树脂的容器中，密封，干冷处理20min，室温下反应6-4h。DCM、甲醇和乙氰（ACN）洗涤。

加入碘乙烷的乙腈（10ml ACN/g CTC树脂）溶液，反应7-8h。

甲醇、DMF洗涤，得到乙氨基CTC树脂（II-1），记为EtNH-CTC Resin。步骤2，偶联氨基酸Pro1eq EtNH-CTC Resin与4eq Fmoc-Pro-OH，在3.5eq BOP和8eq NMM存在下，25-30℃反应10小时，得到Fmoc-Pro-EtN-CTC Resin。

20%哌啶溶液中，DMF存在下，脱除保护基Fmoc，反应温度为20-25℃，反应时间为30min。得到NH2-Pro-EtN-CTC Resin。

步骤3，偶联氨基酸Arg(NO2)

加入3eq Fmoc-Arg(NO2)-OH，在3eq DIC+1.5eq NMM+3eq HOBT存在下进行偶联反应，具体操作可以参考现有固相合成多肽的技术。然后采用步骤2中同样的方法脱除保护基Fmoc，得到NH2-Arg(NO2)-Pro-EtN-CTC Resin。

步骤4，偶联其它氨基酸

采用与步骤3相同的方法，根据醋酸布舍瑞林的肽链结构，依次加入Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH、Fmoc-Trp–OH，依次偶联第三至第九个氨基酸（3-9AA）：Leu、D-Ser(tBu)、Tyr(Bzl)、Ser(Bzl)、Trp、His(Trt)、和Pyr。

得到全保护的9肽树脂Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NEt-CTC Resin。

步骤5，去除CTC树脂

2%（v/v）三氟乙酸（TFA）的DCM溶液中，搅拌30min，过滤，去除树脂，滤液用10%（v/v）NMM/DCM溶液中和，减压浓缩。

得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt。

步骤6，氢化脱除保护基

全保护肽溶于甲醇中，通入H2，压力保持为2.5MPa，以10%（v/v）Pt/C为催化剂，反应24h，脱除D-Ser(Bzl)之外的其它各氨基酸的侧链保护基，过滤，滤液浓缩至干，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt粗产品粉末。

将粗产品粉末溶于甲醇中，加入冷乙醚沉淀，离心分离，真空干馏，得到醋酸布舍瑞林粗产品，纯度88%，然后通过反相高效液相色谱纯化，得到高纯度醋酸布舍瑞林，纯度99.5%，总体收率为39%。

主要参考资料

[1] 胡蕾, 刘松青, & 戴青. (2010). 醋酸布舍瑞林纳米粒的制备及体外释放特性研究. 中国药房(29), 2757-2760.

[2] 陆冬冬, 乔春华, 张国庆, 白俊才, & 谈技. . 固液结合法合成抗肿瘤多肽药物醋酸布舍瑞林. 中国医药工业杂志(11), 11-15.

[3] 胡蕾, 刘松青, & 戴青. (2010). 醋酸布舍瑞林缓释纳米粒灭菌粉末的处方工艺研究及质量评价. 中国药房(41), 3895-3897.