LixisenatideAcetate的制备

概述^[1-2]

LixisenatideAcetate为醋酸利西拉来，是含有44个氨基酸的多肽，是由Sanofi-Aventis公司开发的1日1次皮下注射用胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂，主要用于治疗II型糖尿病，于2013年02月01日Sanofi-Aventis的利司那肽被EMEA批准，用于接受稳定剂量基础胰岛素（或联合二甲双胍）治疗不佳的II型糖尿病患者的辅助治疗以改善HbA1c和餐后血糖水平。

制备^[2]

步骤一：Fmoc-Ser(tBu)-OSu活化酯的合成

称取383.44g Fmoc-Ser(tBu)-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入2000ml THF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到445.50g Fmoc-Ser(tBu)-OSu活化酯，收率89%。

步骤二：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH的合成

称取80.60g H-Ser(tBu)-OH（0.5mol）、250.28g Fmoc-Ser(tBu)-OSu（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到286.47g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，收率89%。

步骤三：Boc-Gly-OSu活化酯的合成

称取176.20g Boc-Gly-OH（1.0mol），138.10g HOSu（1.2mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入247.59g DCC（1.2mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到258.12g Boc-Gly-OSu活化酯，收率88%。

步骤四：Boc-Gly-Ala-OH的合成

称取146.66g Boc-Gly-OSu（0.5mol）、44.55g H-Ala-OH（0.5mol）和79.50g Na2CO3（0.75mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到168.26g Boc-Gly-Ala-OH，收率88%。

步骤五：H-Gly-Ala-OH的合成

称取168.26g Boc-Gly-Ala-OH，加入加入到500m lTFA和500ml DCM的混合溶液中溶解，室温下反应3小时，母液旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到118.05g H-Gly-Ala-OH，收率95%。

步骤六：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu的合成

称取286.47g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH（0.45mol）、62.15g HOSu（0.54mol）加入1000ml THF中，冰水浴下加入111.42g DCC（0.54mol），反应1小时，升温到室温反应3小时，反应液过滤，母液旋干，加DCM溶解，过滤，饱和碳酸氢钠洗3遍，纯水2遍，反萃2遍，合并有机相，无水碳酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯和石油醚重结晶3次，过滤，固体油泵拉干得到291.04g Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu活化酯，收率85%。

步骤七：Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH的合成

称取291.04gFmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OSu（0.38 mol）、107.32g H-Gly-Ala-OH（0.38 mol）和60.42g Na2CO3（0.57 mol）加入到500ml水和500ml THF的混合溶液中溶解，室温下反应过夜，用10%稀盐酸调节PH到7，旋蒸除去THF，之后调节PH到3。得到大量白色沉淀，过滤。将得到的白色沉淀用乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到319.48g，其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度为97.95%，收率82%。

步骤八：利西拉来-Rink Amide AM Resin 树脂的合成

称取取代度为0.20mmol/g的Rink Amide AM Resin树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联，偶联完毕，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护5分钟，然后用DMF洗涤3次，再用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护10分钟，然后用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到129.92 g 利西拉来-Rink Amide AM Resin树脂。其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Met-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。

步骤九：利西拉来-Rink Amide MBHA Resin 树脂的合成

称取取代度为0.20mmol/g的Rink Amide MBHA Resin树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取14.06g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.05g HOBt(30mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入3.88g DIC(30mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。

重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中32、33、34、35氨基酸偶联采用片段Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联，偶联完毕，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护5分钟，然后用DMF洗涤3次，再用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护10分钟，然后用DMF洗涤6次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，抽干得到137.65g 利西拉来-Rink Amide MBHA Resin树脂。其中Fmoc-Arg(Pbf)-OH偶联时溶剂换为：选用体积比为1:4的DMSO和DMF混合溶液；Fmoc-Met-OH偶联时偶联试剂换为：PyBOP/HOBt/DIEA；Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-OH偶联时偶联试剂换为：HATU/HOBt/DIEA。

步骤十：利西拉来粗肽的制备

称取137.65g 全保护的利西拉来-Rink Amide MBHA Resin树脂，加入到1000mL的三口圆底烧瓶中，按体积比为90:5:3:2的TFA、苯甲硫醚、苯甲醚和EDT混合溶液配置裂解液500mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰乙醚中沉淀1小时，离心，无水乙醚离心洗涤6次，真空干燥，得到利西拉来粗肽44.70g，HPLC纯度83.98 %，粗肽收率80%。

步骤十一：利西拉来精肽醋酸盐（LixisenatideAcetate）的制备

称取上述44.70g利西拉来粗肽用45L水溶解后，通过C18柱纯化，次纯化条件：流动相为：A相：0.1 %TFA；B相：乙腈；梯度程序为：15％B，60分钟内至60％B；检测波长220 nm；收集目的峰馏分。第二次纯化条件：流动相为：A相：0.3%HAC；B相：乙腈；梯度程序为：10％B，60分钟内至60％B；检测波长220 nm；收集目的峰馏分。脱盐的条件：流 动 相：A相：20 mmol/L乙酸铵的水溶液:乙腈=95:5；B相：水:乙腈=95:5；C相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=95:5；D相：0.03 %醋酸的水溶液:乙腈=50:50；梯度程序为：以流动相A等梯度洗脱15分钟，转换成流动相B等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相C等梯度洗脱10分钟, 转换成流动相D等梯度洗脱25分钟；检测波长220 nm；收集目的峰馏分；旋蒸浓缩，冻干得到利西拉来醋酸盐精肽22.65g，HPLC纯度99.75%（面积归一化法），Di-Ser33-利西拉来为0.03%（面积归一化法），Di-Ala35-利西拉来含量为0.05%（面积归一化法）。纯化总收率51%，总收率41%。

主要参考资料

[1] CN201210030151.2 一种合成利西拉来的方法

[2] CN201410357788.1 一种制备利西拉来的方法