高保真酶预混液的应用

背景^[1-3]

高保真酶预混液是一种DNA扩增预混液，包含引物和模板之外扩增完全反应必需成分。适用PCR、NGS高通量测序文库等的扩增。预混液所含KAPA HiFi DNA Polymerase是新型改造B族DNA聚合酶，错误率比野生型Taq DNA聚合酶低约100倍，成功率和产率比野生型B族proofreading活性的DNA聚合酶更高。高保真酶预混液是即用型预混合溶液，包含High-Fidelity DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系。High-Fidelity DNA Polymerase是新一代的高保真DNA聚合酶，具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，其保真性是Taq DNA聚合酶的52倍，是普通Pfu DNA聚合酶的6倍。扩增速度可达15 sec/kb。适用于复杂模板的扩增，扩增产物为平末端。 

特性^[4-6]

高保真酶预混液具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，反应体系只需加入引物和模板即可进行扩增，简化了实验操作步骤，减少了人为误差，提高了实验通量和结果的重复性。本产品中不含染料，PCR产物需加入Loading buffer后进行电泳。另外，该产品还含有特异保护剂，使得预混液反复冻融后仍可维持稳定活性。高保真Taq酶，一种用于克隆的生物质酶，高保真Taq酶保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可降到10-6数量级，大大降低了出错的可能性；它适合对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、测序、突变检测等。

高保真Taq酶的保真原理是：高保真Taq酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性；需要提醒的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还会降解引物，而且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。

高保真Taq酶的外切活性会导致PCR反应之后不会加尾，所以如果要进行TA克隆，要先进行PCR产物回收（否则影响加尾），然后回收产物用普通Taq酶72℃保温一段时间，从而利用普通Taq酶加尾的活性。

应用^[7][8]

用于基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因突变检测中的应用研究

高保真DNA聚合酶介导的基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因缺失突变检测中的应用。方法:选取与肺癌密切相关的EGFR基因19号外显子上的两种非移码缺失突变del E746–A750(del 2235–2249)和del L747–P753 insS(del 2240–2257),即15nt和18nt缺失突变为检测靶点,分别设计3’末端与野生型基因位点或突变基因位点配对的引物,并硫化磷酸修饰;采用高保真DNA聚合酶联合3’末端硫代修饰的特异性引物所构成的基因突变敏感性分子开关,对含有相应缺失突变的阳性质粒模板及正常人基因组DNA模板进行分析和方法评估。在48℃到68℃大范围退火温度下,采用梯度PCR结合凝胶电泳,比较了有硫化修饰和无硫化修饰引物,在高保真酶介导的缺失突变检测中的区别;比较了Taq酶与Pfu酶介导的3’硫化修饰特异性引物延伸反应在缺失突变检测中的特异性及可靠性。

采用荧光定量PCR,评估高保真酶介导的敏感性分子开关在荧光定量PCR中的敏感性和相关性。结果:高保真酶介导的敏感性分子开关准确识别了肺癌EGFR基因15nt和18nt的缺失突变。在48°C到68°C大范围退火温度下,敏感性分子开关在突变模板上得到特异性的扩增产物,而在野生模板上起到“关”的效应,特异性随退火温度提高而增强。重组质粒定量后,稀释成10~8、10~7、10~6、10~5、10~4、10~3、10~2、10~1拷贝数/μl浓度梯度作为阳性模板,显示敏感性分子开关在普通PCR结合凝胶成像电泳中,15nt缺失突变检测分子开关可检测的起始拷贝数为3000突变分子,而18nt缺失突变检测分子开关敏感性更高,可检测的起始拷贝数为10突变分子。对照组中,采用Taq DNA聚合酶或3’末端无硫代修饰的特异性引物,均易产生假阳性且呈退火温度依赖性。将上述15nt缺失突变阳性模板用于制定荧光定量PCR的标准曲线,结果显示,定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.990。

参考文献

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[2]Superb nucleotide discrimination by a novel on/off switch for DNA polymerization and its applications[J].Kai Li,Jia Zhang,Linling Chen,Steve S.Sommer.Molecular Biotechnology.2005(2)

[3]SNP discrimination through proofreading and OFF-switch of Exo+polymerase[J].Jia Zhang,Kai Li,Jose R.Pardinas,Duan F.Liao,Hong J.Li,Xu Zhang.Molecular Biotechnology.2004(1)

[4]Efficient mutagenesis method for producing the templates of single nucleotide polymorphisms[J].Jia Zhang,Kai Li,Zemin Deng,Duanfang Liao,Weiyi Fang,Xu Zhang.Molecular Biotechnology.2003(2)

[5]De Novo synthesis of PCR templates for the development of SARS diagnostic assay[J].Jia Zhang,Bo Meng,Duanfang Liao,Lvyi Zhou,Xu Zhang,Linling Chen,Zifen Guo,Cuiying Peng,Bingyang Zhu,Peggy P.Lee,Xiangmin Xu,Tianhong Zhou,Zemin Deng,Yinghe Hu,Kai Li.Molecular Biotechnology.2003(2)

[6]Single-base discrimination mediated by proofreading 3′phosphorothioate-modified primers[J].Jia Zhang,Kai Li.Molecular Biotechnology.2003(3)

[7]Potential of 5-aza-2′-deoxycytidine(Decitabine)a potent inhibitor of DNA methylation for therapy of advanced non-small cell lung cancer[J].Richard L Momparler,J Ayoub.Lung Cancer.2001

[8]肖莉.基因突变敏感性分子开关在肺癌EGFR基因突变检测中的应用研究[D].南华大学,2007.