原代小鼠心肌成纤维细胞分离培养方法

小鼠心肌成纤维细胞的组织来源于实验动物的正常心脏组织，心脏是脊椎动物身体中最重要的一个器官，主要功能是提供压力，把血液运行至身体各个部分。心脏的作用是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、无机盐、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。

心脏中，心肌成纤维细胞约占正常心肌组织细胞总数的60%-70%，是心脏中非心肌细胞的主要组成部分，广泛存在于心脏组织中，包围心肌细胞，连接心肌细胞间质，与缺血性心脏病、炎症、肥大、梗死等病理状态密切相关。细胞生长方式以长梭状细胞，贴壁培养。

小鼠心肌成纤维细胞的方法有很多，赛百慷提供的心肌成纤维细胞分离方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分离和培养原代细胞。

实验器械

1.培养皿

2.T-25细胞培养瓶

3.100目不锈钢网筛

4.200目不锈钢网筛

5.眼科剪

6.眼科镊

7.离心管（15ml、50ml）

实验分离和培养步骤

1. 小鼠颈椎脱臼处死后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。

3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织，仅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。     

 A.贴块法

6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3-5min。

7. 消化完成后，添加数毫升FBS终止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1次后，用200ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2-4h。

8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml完全培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触所有的组织块。

9. 之后放入培养箱中继续培养，一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。

 B.消化法

6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8min后，吸取上层混悬液弃去。

7. 余下组织加入混合消化液10ml，37℃水浴震荡消化10min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。

8. 按1∶1加入含血清的培养基，中止酶反应，悬液过150目网筛去除较大的组织块。

9. 收集全部中止后的消化液于离心管中，300g，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬细胞后计活细胞数。

10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中，每瓶添加2ml细胞悬液。

11. 培养瓶放置于37℃，5% CO2培养箱中静置40min后，吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞，再添加5ml完全培养基继续培养。
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