如何正确选择液相色谱柱

一、色谱柱参数及其意义

选择色谱柱时应考虑不同色谱柱参数的影响，以下内容对色谱柱的参数进行分析。

1、色谱柱尺寸

较长的色谱柱组分保留较强，运行时间较长，柱效更高，分离度效果更好。在实际工作中应综合衡量运行时间和柱效，选择长度适宜的色谱柱。例如含量测定、溶出检测对于分离的要求较低，可选用较短的色谱柱，减少运行时间；有关物质一般选择较长的色谱柱，提高分离效果。

内径小的色谱柱灵敏度较高，峰型更窄，但是载样量较小。如果载样量满足要求，需要更高更尖锐的峰提高灵敏度，可以选择更小内径。但是如果进样量超过了柱载样量，色谱峰将极大变宽。所以应在灵敏度和载样量之间综合衡量。

粒径小的色谱柱分离度较好，色谱柱压力更大。如果5μm粒径的色谱柱分离度稍有不足，则同型号3μm色谱柱的分离度一般会提供令人满意的选择性。

如果选择较小尺寸的色谱柱，应衡量柱外死体积对柱效的影响，柱外死体积包括连接管线、进样体积、色谱柱接头与色谱柱连接处的空隙等。所以一般超高效液相使用的色谱柱不适用于常规液相仪。小规格色谱柱使用同一品牌的仪器，减少连接处空隙引入的死体积。题外话：岛津、安捷伦、waters之间仪器管线接头和色谱柱不匹配，仪器和色谱柱品牌不一致必然引入较大连接空隙，应注意这方面的影响。

2、其他参数

高比表面积具有较强的保留能力、柱容量和分离度，低比表面积能更快达到平衡状态，这点在梯度淋洗中很有意义。

大孔径的填料可以延长大分子在填料中的滞留时间，达到充分分离，改善峰型。大分子样品一般应选择较大孔径色谱柱，如蛋白质、多肽类。

单齿键合色谱柱平衡更快；双齿键合稳定性较好，柱容量较大。

碳栽量大保留较强，分离效果较好。反之保留较弱，分离效果较差。

封尾（也称封端）柱能减轻碱性组分（阳离子）与硅胶表面残留硅氧负离子作用而引起的色谱峰拖尾现象；对于极性样品经封尾处理与未经封尾处理的色谱柱选择性也不同。一般碱性化合物应选择封尾处理的色谱柱。

二、常见固定相解析

1、直链烷烃（C18、C8、C6、C4、C3……）

非极性和极性较弱的化合物常选择该类固定相色谱柱。一般来说，链长越长，柱容量更大，保留时间更长，分离效果更好，柱稳定性更好。因此C18是最常用的一种反相色谱柱，但是某些组分如大分子样品因其保留太强，使用C18难以洗脱，会用到更短链固定相色谱柱（如C4等）。在开发方法的时候如果使用C18柱，最难洗脱的组分在流动性允许的有机相最高比例下保留仍然太强导致运行时间际过长，就可以考虑使用C8柱。

该类固定相的保留机制是“相似相溶”的液液分配色谱，固定相为小极性碳链，组分中依极性大小的不同而保留不同，极性越小保留越强。组分在该类色谱柱中的保留可根据极性的相对大小判断不同组分的洗脱顺序。例如苯与苯酚，苯酚因为多了一个羟基，极性变大，在C18柱中更快洗脱下来。

该类柱在方法开发上有一个的优点是保留情况可以预测，比如一般减少有机相比例会增加保留，分离度增加等等。

2、苯基 

保留机制同直链烷烃，它对于含苯环结构的化合物有良好的分辨能力，尤其是苯环上的细微差别，如结构式中有无卤素、官能团在苯环所处位置不同等。

3、氰基

CN(氰基)填料由于其具有中等极性的氰基键合固定相，其既可用于正相色谱，又可用于反相色谱。其在用于正相色谱时，可使用如正己烷的低极性流动相，在用于反相色谱时，可使用甲醇或水的强极性流动相。

CN柱的疏水性在反相色谱固定相中相对较低，并且由于具有π-电子作用腈基，其与ODS相比显示出不同的选择性。CN柱适用于在ODS上保留时间太长的组分的分离，以及在ODS上优化色谱非常困难的场合。CN柱也可用于在ODS上保留太小的强极性化合物的检测。如果组分间极性相差太大，CN柱或许可以提供一个令人满意的结果。如本人曾经在一个项目的溶出方法学研究中发现，药典方法规定的C18柱在多次分析溶出样品后主峰变形，经过调查确认是胶囊壳中强保留组分无法洗脱引起，于是选择CN柱，连续分析数千样品，柱效依然良好。

CN柱的保留随着有机相比例变化的趋势不像直链烷烃柱那么明显，有些情况下有机相变化百分之几十，保留时间也未发生明显变化，这点需要注意。

4、氨基

氨基柱是由极性基团氨丙硅烷基键合在硅胶上形成的极性键合相色谱柱。一般可正相使用，也可反相使用。一般用于糖类、碳水化合物的分析。

目前氨基柱的分离原理主流说法是氢键作用力及范德华力，由此可以看出氨基柱一般不用于易解离化合物的分析。原因有二：一是氨基柱非常不稳定，易解离化合物一般都需要使用缓冲盐，加速了氨基柱固定相的破坏；二是氨基柱对于易解离化合物的保留机制非常复杂，除了上述的氢键和范德华力外，还有离子交换色谱的机制，如碱性化合物与氨基固定相相互离子间排斥、酸性化合物与氨基相互吸引等，使得色谱行为更加难以预测。目前氨基柱最常用于糖类的分析，流动性使用水-有机相系统。

该类色谱柱的缺点就是稳定性差，柱的使用寿命非常短。

5、HILIC（亲水作用色谱）

本柱为两性离子的固定相共价结合于多孔硅胶上，适用于反相色谱中保留较弱或者根本不保留的强离子化样品检测，解决了正相色谱用于该领域样品难以溶解性的问题。这是比较新的一类色谱柱，目前相应的研究内容较少。

HILIC柱的分离机制非常复杂，主要包括以下几个方面：液液分配、离子交换、偶极-偶极间作用、氢键等，很多实验表明HILIC的保留机制是上述多种机制的共同作用。

典型的HILIC流动相一般为水或缓冲液中含40%-97%乙腈，一般不应使用纯乙腈。组分的保留时间一般随着有机相比例的增加而增加，随着水的比例增加而减少。所以梯度设置和反相色谱正好相反，是一个有机相比例逐渐减少的过程。

样品不得使用纯水溶解，水的比例与流动相初始比例一致，原理与反相色谱常见的“溶剂效应”一样。

6、离子交换柱

分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，主要用于强离子组分的检测，如金属离子、酸根等的检测。最常见用于离子色谱仪，如组分有紫外响应，也可以用于一般液相仪中。其原理及应用已有较多的研究内容，本文就不做详细介绍。

7、其他

上述6类色谱柱已经包含了绝大部分的实验室常见色谱柱，其他如手性柱或特殊填料色谱柱由于性质差异较大或应用较少，篇幅有限本文就不做详细介绍了。

三、色谱柱相关的一些其他内容

1、色谱柱流向

一般来说，应安装色谱柱上规定的箭头方向设置流动相的方向。如色谱柱压力明显增高，可将色谱柱断开检测器调头反冲，如此操作之后色谱柱反向使用。避免频繁更换色谱柱中流动相的流向，因为色谱柱的键合相是有排列方向的，频繁更换色谱柱中流动相的流向会破坏这种排列，降低色谱柱性能。

2、pH值稳定性

上文中提过键合相碳链越长越稳定，其意义是越长的碳链在低pH值下不易水解，由此可以得出结论是经过短链封尾处理的色谱柱应避免在低pH值（＜2)条件下使用。在高pH值下，由于硅胶上带有硅氧负离子，硅胶将会溶解，由此可以得出封尾处理后的色谱柱在高pH值下稳定性较好的结论。在方法开发及样品检测中可以根据上述结论选择色谱柱，提高色谱柱寿命。

四、后述

之前在拙著《液相方法开发指南-反相色谱》一文中挖了一个关于色谱柱的坑，估计会有读者心中不满，看完本文亲应该能发现并非有意这么做，实在是内容太多，一篇文章包含不了那么多的内容。当然还是要向各位致歉。