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生化研究

胆红素是动物体内含铁卟啉化合物进行正常分解代谢的产物，是铁叶琳化合物在人体内代谢产物之一。胆红素在体内起着重要的作用，它是一种抗氧化剂，有助于肝细胞的再生。但是，一旦出现代谢异常，胆红素就会在体内积累，形成高胆红素血症，甚至黄疸。凡能引起胆红素生成过多或使肝细胞对胆红素的摄取、结合和排泄过程发生障碍，都会使血中的胆红素浓度升高，出现高胆红素血症。因此，胆红素的测定对临床检测肝胆疾病、溶血等具有重要的意义。
胆红素氧化酶（bilirubin：oxygen oxidoreductase，EC1.3.3.5，BOD/Br/BOX）是一种多酚氧化酶，最开始对胆红素氧化酶进行研究的是国外的两名学者Murao和Tanaka，他们从漆斑菌属真菌中纯化出胆红素氧化酶，为后来胆红素氧化酶的各项研究及应用奠定了重要理论基础。胆红素氧化酶的来源特别广泛，漆斑菌属是其主要来源和高产菌，产生胆红素氧化酶的微生物有链霉菌属、弗兰克氏菌、粗皮灵芝、微紫青霉菌等；Maitins在研究中发现，枯草芽孢杆菌、芽孢外衣蛋白也有胆红素氧化酶活性；此外，国外科研人员在马铃薯洋葱苜蓿和番茄等植物中也都陆续分离出胆红素氧化酶。胆红素氧化酶能催化胆红素反应生成无毒害作用的胆绿素，主要被用于测定血清中胆红素的含量，而血清中胆红素含量的多少可以作为肝胆病情诊断的重要依据，也能为病理分析提供信息。

胆红素氧化酶全酶是由蛋白质、二价铜离子和部分碳水化合物组成。蛋白质 由17种氨基酸组成，不含半胱氨酸、赖氨酸和蛋氨酸含量较低，每个分子中不到10个残基；天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸含量较高，每个分子中的残基数超过 40个。胆红素氧化酶的前体是由572个氨基酸残基组成，包括534个氨基酸和38个氨基酸的前导区。前导区中碳末端的个疏水氨基酸与已知信号肽特征相似，可能也起着信号肽的作用。
胆红素氧化酶（BOD）的光谱学特性与多铜氧化酶基本相似，纯化后的BOD常呈深蓝色，BOD中含有的铜离子依光谱学和磁学特性被分为3种类型，T1铜中心接受来自于酶的有机底物电子供体如胆红素并将所得电子传递到O2还原位点，目前被广泛接受的观点是该蛋白的紫外-可见光谱在约600nm处有一强吸收T1铜特征吸收峰，这主要源于酶底物中的电荷从Cys-S到T1CuII的传递继而电子再被传递至O2还原位点，这一位点由1个三核中心组成，包含1个具有电子 顺磁共振活性的T2Cu2+中心和一对逆磁性与羟基耦合的T3铜离子该三核铜中心，，在UV-Vis区约330nm处有一明显的宽肩作为其特征，2010年亿报道从M．verrucarria分离纯化并获得首个BOD晶体结构，此后有关此酶晶体结构的进一步研究也陆续被报道。

胆红素氧化酶是一种含铜的多酚氧化酶，它包含三种类型的铜离子。一个I型铜离子介导电子从底物传到其他铜位点，氧分子束缚在一个II型铜离子和两个III型铜离子形成三核中心上，被还原为两个水分子。所以其催化过程是利用分子氧作为电子受体，有水生成的氧化反应。经电子吸收光谱及薄层色谱技术测定，具体反应为 ，过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素，后者进一步氧化生成部分性质还不明确的无色物质。研究表明胆红素氧化酶的催化机制是对于被束缚在蛋白质上铜离子的二级反应，供体结构为CuSS*N2(S=Cys，S*=Met，N=His)类型，和铜蓝蛋白家族相同（如下图）。
在对黄疽血液进行胆红素氧化酶反应中，用HPLC法测定血液中胆红素浓度在用胆红素氧化酶催化后的变化，发现胆红素氧化酶可以氧化结合型胆红素，也可以氧化非结合型胆红素。在ph=5.5和氟化钠等试剂存在时，胆红素氧化酶能选择性地氧化结合型胆红素。这种方法能被用于检测病人血清中结合胆红素浓度的变化。

胆红素氧化酶（BOD）酶活与温度没有明显的相关关系。M.oryzae BOD酶活最高温度为60℃，CotABOD酶活最高温度达80 ℃，而来自M．verrucarria的BOD酶活最高温度只有40 ℃。在多铜氧化酶家簇中CotA蛋白具有最高的热稳定性，在80℃下半衰期100min，而表现出细菌蛋白酶的显著特性。目前对此现象的解释有2种，1种使这种蛋白分子的结构较其他蛋白更加紧密，另一种是通过蛋白晶体结构发现这种蛋白中的铜被埋在蛋白质更深的结构里所致。在真菌BOD中来源于M.oryzae的BOD是目前发现最稳定的一个，其半衰期在37℃下300min，在60℃下70min，相比之下自然分泌的M．verrucarriaBOD在60 ℃下的半衰期只有15min，而其在Pachiapastoris中表达的重组蛋白半衰期在相同温度下可达90min。来自T．tsunodae的BOD14在37℃下90min后酶活丧失50％，与漆酶不同BODs在中性条件下稳定如来自于M.oryzae的BOD在生理条件下孵育8d只丧失15％的酶活性。

• 用于临床检测和治疗

胆红素氧化酶在医学方面的用途广泛，主要用来测定血清中测定胆红素和总胆红素的含量，对肝胆疾病的监测比化学方法更为敏感准确，从而为病理分析提供详细信息。为了方便测定，现已将胆红素氧化酶制成试剂盒，在临床上能够快速测定病人的胆红素含量，并诊断黄疸水平此外，重度黄疸病患者在临床治疗时需要测定病人血清中的肌酐，但是在测定过程中会受到血清中胆红素的干扰，而胆红素氧化酶恰好可以用来消除血清中胆红素的干扰，从而保证肌酐测定的正常进行和提高数值的可靠性。胆红素氧化酶是一种胞外酶，不容易分离，并且在分离纯化的过程中，性质不稳定，酶活会大大降低，降低了产量为了克服以上问题，我们可以将酶进行固定，固定后的酶其性质更加稳定，能够提高酶的催化效率，并且易于调节和控制酶反应，还可以减少使用过程中的有害作用，治疗效果更好

•  用于环境污水的处理

随着工业的快速发展，越来越多的化工及印染废水排到环境中，造成一定的污染 一直以来，处理废水的方法主要是物理法和化学法，物理法处理污水速度慢周期长，化学处理也不尽人意。随着对酶的深入研究，生物法处理污水成为可能 胆红素氧化酶和漆酶都是多酚氧化酶类，因此具有相似的性质和作用。漆酶的应用范围很广，这也为胆红素氧化酶的应用研究指明了方向。漆酶主要用于工业染料的降解方面，胆红素氧化酶也具有染料脱色作用，在染整工业中，酸性靛蓝的作用是进行棉纤维的脱色，使用过程中会产生大量含酸性靛蓝染料的废水，给环境造成污染通过研究，漆斑菌发酵产生的胆红素氧化酶能够对染料酸性靛蓝进行降解。此外，经疣孢漆斑菌产生的胆红素氧化酶可以高效降解染料靛红，显示出胆红素氧化酶在污水处理和环境保护方面的应用前景。

• 用于生物电池的制造

随着环境能源问题的日益突出，开发绿色无污染可再生的生物能源一直备受关注。胆红素氧化酶可以被固定在电极上，制成生物燃料电池。生物燃料电池（biological fuel cell，BFC）是由天然的酶作为催化剂或者通过生化过程中的电化学反应将化学能直接转变为电能的一种特殊的生物电池，特点是：染料来源广泛反应条件温和生物相容性好。酶处于游离状态时性质不稳定，容易失活，因此，一般将酶固定在电极上，以提高酶的使用效率。近年来研究较多的是将酶固定在聚吡咯聚苯胺等聚合物膜上，Halliwell 等研究人员在碳电极上覆盖一种聚苯胺膜，再将其浸在酶液中，制成生物催化电极。随着对酶固定载体的研究，将酶固定在能导电的聚合物上，这样，可以极大地缩小生物电池的体积，为在人体内植入动力装置提供可能。但是，又出现了一个新的问题，内置电池必须在人体生理条件下工作，对此，Mano等研制了一种聚阳离子膜，这种膜是聚丙烯酰胺和聚［氮-乙烯基咪唑］螯合另一种物质得到的，这种电池当胆红素氧化酶在人体生理条件下电流密度可以超过2mAcm-2，并且更加稳定。在近几年的研究中，电极不再使用复合物膜，而是碳纤维，从而使得电池体积进一步缩小（如图）。

露湿漆斑菌产生的胆红素氧化酶粗酶液通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex G-100 纯化，得到纯化152.54倍胆红素氧化酶，得率19.14 %。
酶的分离与纯化过程为：
1）硫酸铵盐析、透析：菌种在 28℃下、P DB培养基中摇瓶培养5d后，经8 层纱布过滤，6000r/min 离心20 min ，所得上清液冷冻过夜，解冻除去沉淀， 上清液即为粗酶液。80 %饱和度硫酸铵沉淀，4℃ 静置过夜。10000r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀溶解于蒸馏水中，对其透析过夜。
2）DEAE-Sepharose Fast Flow 柱层析：将上述所得酶液加到已用0.01mol/ L 磷酸钠缓冲液（PBS7.0）平衡过的DEAE-Sepharose Fast Flow柱（1.8 cm×20 cm）， 先用PBS 洗柱，后改用含0～0.5 mol/LNaCl的PBS梯度洗脱，合并有酶活组分， 将所得溶液冷冻干燥成粉。
3）Sephadex G-100 柱层析：将上述所得活力组分的冻干粉溶解于3mL蒸馏水中，所得酶液加到平衡好的层析柱（2.0 cm×80 cm）上，用上述缓冲液洗脱，收集活力较高的组分，并将其冻干，溶解在 2mL的蒸馏水中，-20 ℃下保存。

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