细胞培养操作规程：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
以下是小鼠皮下脂肪细胞提取物图片的订购信息：
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产品名称
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规格
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货号
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小鼠皮下脂肪细胞提取物图片
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详见说明书
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FSX6807
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小鼠皮下脂肪细胞提取物是从小鼠原代皮下脂肪细胞提取的，小鼠原代皮下脂肪细胞从正常小鼠脂肪组织制备。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。
总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。公司提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。
cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。
蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备小鼠皮下脂肪组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。
潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。
实验报告：
一分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
维生素CHuman APPL2(DCC-Interacting Protein 13-Beta) ELISA Kit
L-谷氨酸Human ARHGDIB(Rho GDP-dissociation inhibitor 2) ELISA Kit
L-谷氨酸Human ARNTL(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1) ELISA Kit
L-谷氨酸Human ASTL(Astacin-like metalloendopeptidase) ELISA Kit
L-缬氨酰胺盐酸盐Human ATG7(Autophagy-related protein 7) ELISA Kit
L-缬氨酰胺盐酸盐Human ATPB(ATP synthase subunit beta) ELISA Kit
L-缬氨酰胺盐酸盐Human AXL(Tyrosine-protein kinase receptor UFO) ELISA Kit
溶壁酶Human BNIP3L(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like) ELISA Kit
十二醛Human BTNL2(Butyrophilin-like protein 2) ELISA Kit
十二醛Human C10orf58(Redox-regulatory protein FAM213A) ELISA Kit
L-天门冬氨酸-4-叔丁基酯Human C1orf31(Cytochrome c oxidase assembly factor 6 homolog) ELISA Kit
L-天门冬氨酸-4-叔丁基酯Human C5AR1(C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1) ELISA Kit
L-天门冬氨酸-4-叔丁基酯Human CAMK2B(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit beta) ELISA Kit
L-脱氢抗坏血酸Human CAMK2D(CaMKII delta) ELISA Kit
L-脱氢抗坏血酸Human CAP2(Adenylyl cyclase-associated protein 2) ELISA Kit
小鼠皮下脂肪细胞提取物图片O/F 试验用培养基文多灵 ≥98.0% (HPLC)soluble CD38
我妻氏血琼脂基础硫酸长春新碱 98%Soluble Cluster of differentiation 40 ligand
3%NaCl 阿拉伯糖辣椒素 97%sCD44v6
3%NaCl 乳糖牡荆素 分析标准品，≥98%ENG;sCD105
3%NaCl 蔗糖牡荆素鼠李糖苷 分析标准品，≥98%soluble E-selectin
3%NaCl 甘露醇牡荆素-2-O-鼠李糖苷 分析标准品，≥98%Soluble FMS-like tyrosine kinase 1
培养基4-溴苯磺酰氯 98%soluble major histocompatibility complex class I chain-related gene A
副溶血性弧菌套装生化鉴定管 12 种SN0173D(-)-水杨苷 98%soluble major histocompatibility complex class I chain-related gene B
改良磷酸盐缓冲液1,3-丙磺酸内酯 99%solution OX40 Ligand
改良磷酸盐缓冲液环己基苯 98%sP-selectin
碱处理液碳酸亚乙烯酯 包含 <2% BHT稳定剂,98%sCD146
改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤碳酸乙烯亚乙酯 99%soluble growth STimulation expressed gene2
改良克氏双糖铁培养基环丁砜 分析标准品,≥99.8% (GC)soluble Toll-like receptor 6
培养操作：
1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分 变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养 瓶后加少量培养基终止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 4 分 钟，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加 入血 清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻 存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80 度冰箱，2 个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取.
