EMSA探针生物素标记试剂盒

EMSA探针生物素标记试剂盒

EMSA探针生物素标记试剂盒(EMSA Probe Biotin Labeling Kit)是一种通过Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素标记的dUTP添加到单链DNA 3'末端，然后通过退火产生生物素标记的EMSA探针的试剂盒。通常DNA的3'末端被标记后不会干扰基于序列特异性蛋白结合的EMSA检测。
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)可以在不依赖于模板的情况下催化在DNA的3'-OH端加上dNTP的反应。关于TdT催化双链DNA末端加dNTP的反应效率，3'端突出的双链DNA要比平端或3'端缩进的双链DNA高很多。TdT催化单链DNA末端加dNTP的反应效率要比双链DNA高很多。在适当的条件下，TdT也可以催化RNA 3'末端加NTP的反应。
本试剂盒适合标记纯化的单链DNA，如果用于标记EMSA探针，可以在单链标记后再进行退火。
本试剂盒中提供了已经用生物素标记好的Biotin-Control Oligo，可以用作检测DNA标记效率的对照。
如果每个标记反应的探针量为5pmol，本试剂盒可以用于20个标记反应。
保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
需自备用于检测探针标记效率的带正电荷尼龙膜，以及用于生物素检测的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)可以向信裕生物订购。相应的用于生物素检测的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)也可以向信裕生物订购。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明：
1.准备工作：
A.取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。
2.DNA探针的标记：

A.参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。
C.加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3.TdT的去除：
A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT。(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
B.12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4.探针的纯化(选做)：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：
A.对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。
B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
E.加入50μlTE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。
5.生物素标记探针标记效率的检测：
A.取5μlBiotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μlTE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次 稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和 0.25nM。
B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μlTE，混匀，稀释成10nM生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 
C.参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。 对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2μl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可以使用专门 用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100μl。

D.滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
E.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30-45秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如信裕生物的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。的交联时间可以使用标准品自行摸索
F.随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。
G.如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计算出探针的标记效率。例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同，则说明探针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1μM，而实际被生物素标记的探针约为0.5μM。探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。有文献报道标记效率和3'末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有关。由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3'端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现标记效率大于100%的情况。
6.生物素标记EMSA探针的制备：
A.对于步骤3B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步。
B.加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。 
C.如下设置PCR仪进行退火反应：

注意：如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。
D.退火反应结束后，-20℃保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。