甲型流感（禽流感）病毒H7N9亚型 染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

甲型流感（禽流感）病毒H7N9亚型 染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Influenza Virus A

它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据甲型流感（禽流感）病毒H7N9亚型保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

规格及成分

储存条件：-20℃以下，有效期12个月。

使用方法：

一、样品采集：

1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验要求进行。

2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。

3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。

4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购上海泽叶生物科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

检测步骤：
三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个

样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2．试验成立判定
1）阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。 
2）阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
3）以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
1）在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
2）Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
3）如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
4）对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
1）初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
2）所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
3）PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
4）样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
5）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。