甲型流感（禽流感）病毒H9亚型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

甲型流感（禽流感）病毒H9亚型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。

6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

运输及保存:低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂:DNA 模板、超纯水、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，

充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备

8.如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），

一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9.用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 14810 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤， 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕

后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、数据处理

13.如果把甲型流感（禽流感）病毒H9亚型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

14.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 34 则为阴性，如果小于或等于 30 则为阳性。如果在 30-34 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 34，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。