5’RACE试剂盒

5’RACE试剂盒
产品及特点研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方 法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman 发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下， 利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 3′-端序列。本试剂 盒就是根据 3′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。 
5’RACE试剂盒
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
MMLV 逆转录酶-RI 混合液 101104a 20 μL（红盖）
MMLV Buffer-dNTP 混合液 101105b 60 μL（本色盖）
微量核酸沉淀剂 50903 400 μL（绿盖）
TdT（末端转移酶） 120312 10 μL（白盖）
2×TdT Buffer（含 dATP） 101105c 200 μL（黄盖）
PCR MagicMix 3.0（含染料） 90805 1mL×2（红盖）
5′RACE 引物 A-引物 B 混合液 yw373374 200 μL（蓝盖）
5′RACE 引物 C yw375 200 μL（紫盖）
RNase-Free 水 80403 1 mL（亮黄盖）
使用手册 101105sc 1 份
自备试剂
Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、B、C、75%乙醇。注

自备试剂 Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、基因专一性引物 B、超纯水。

5’RACE试剂盒运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。 

使用方法 一：引物的设计和准备工作 

利用已道序列的区域设计基因专一性引物三条（A、B），其中引物 B 和 A 引物 比较，靠 3’端 10-30 个碱基，类似巢式 PCR 的引物设计。自备的基因专一性引物 的 Tm 跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 为 58℃。引物合成后加 超纯水使其浓度为 10 μM，放冰上待用。 

二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 进行逆转录 

注意：MMLV 酶使用前必须短暂离心，因为它含 50%甘油，及其粘稠，否则将取不 到所需体积。

1. 在一个 PCR 管中，加入以下组分： 

成分 用量

Poly(A) RNA（或总RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）

3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL

MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL

RNase-Free水 补至19 μL

合计 19 μL

注意：如果可能，使用Poly(A) RNA作为模板。

2. 65℃保温 5 分钟, 展开 RNA 的二级结构，立即冰浴待用。

3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合物。

4. 先 37℃保温 60 分钟，再 42℃保温 30 分钟进行逆转录反应，最后 50℃保温 10 分钟终止反应。

5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀释上步得到的 cDNA，冰浴待用。长期放置需要 放-20℃保存。 

三：利用基因专一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 进行轮 PCR

6. 用不同量的 RT 反应液（即稀释后的 cDNA 模板）设置 PCR，样品组需要设置 模板用量梯度，单位：μL。 

7. 按下列参数进行 cDNA 第二链的合成和 PCR：

第 1 步，cDNA 第二链的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合 成第二链的 cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定， 一般可以从 55℃开始）。

 第二步 PCR 循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（此步为 PCR 扩 增，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定，一般可以从 55℃ 开始）。 最后延伸：72℃ 15 分

8. 取 5 μL PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认 PCR 扩增产物。若得到目的扩 增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下 列步骤进行巢式 PCR 反应。

四：利用基因专一性引物 B 和 3′ 

9. 将上轮 PCR 产物（4 管）用水稀释约 20 倍（在 50μL PCR 反应液中加入 1mL 超纯水），然后分别作为模板进行巢式 PCR 扩增。

10. PCR 反应。按下列条件进行 PCR： 第 1-30 次循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（复性温度需要根 据自备基因专一性引物 B 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃开始）。最后延 伸：72℃ 15 分。 

11. 电泳检测。然后根据实验结果进行 DNA 测序或 TA 克隆。