3’RACE试剂盒

产品及特点 研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下，利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 3′-端序列。本试剂盒就是根据 3′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。

3′-RACE 的原理如下图：

规格及成分 成 分 编 号 小扁盒包装

MMLV 逆转录酶-RI 混合物 101104a 10 μL(红盖)

RT Buffer（含 dNTP） 60906 50 μL(白盖)

PCR MagicMix 3.0 90805 1 mL*2(红盖)

3′-RACE 引物 A（10 μM） yw373 10 μL(蓝盖)

3′-RACE 引物 B（10 μM） yw374 100 μL(绿盖)

3′-RACE 引物 C（10 μM） yw375 100 μL(本色盖)

RNase-Free 水 80403 1 mL(亮黄盖)

使用手册 101104sc 1 份

自备试剂 Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、基因专一性引物 B、超纯水。

运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。 

使用方法 一：引物的设计和准备工作

利用已道序列的区域设计基因专一性引物三条（A、B），其中引物 B 和 A 引物比较，靠 3’端 10-30 个碱基，类似巢式 PCR 的引物设计。自备的基因专一性引物的 Tm 跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 为 58℃。引物合成后加超纯水使其浓度为 10 μM，放冰上待用。

二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 进行逆转录

3’RACE试剂盒注意：MMLV 酶使用前必须短暂离心，因为它含 50%甘油，及其粘稠，否则将取不到所需体积。

1. 在一个 PCR 管中，加入以下组分：

成分 用量

Poly(A) RNA（或总RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）

3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL

MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL

RNase-Free水 补至19 μL

合计 19 μL

注意：如果可能，使用Poly(A) RNA作为模板。

2. 65℃保温 5 分钟, 展开 RNA 的二级结构，立即冰浴待用。

3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合物。

4. 先 37℃保温 60 分钟，再 42℃保温 30 分钟进行逆转录反应，最后 50℃保温

10 分钟终止反应。

5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀释上步得到的 cDNA，冰浴待用。长期放置需要

放-20℃保存。

三：利用基因专一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 进行轮 PCR

6. 用不同量的 RT 反应液（即稀释后的 cDNA 模板）设置 PCR，样品组需要设置

模板用量梯度，单位：μL。

成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4

稀释后的 cDNA 1 5 10 15

基因专一性引物 A（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5

3′ RACE 引物 B（10 μM） 2.5 2.5 2.5 2.5

98℃ 5 分变性 RNA-cDNA 杂交链，短暂离心后再加入下列成分

PCR MagicMix 3.0 25 25 25 25

RNase-free 水 19 15 10 5

合计 50 50 50 50

7. 按下列参数进行 cDNA 第二链的合成和 PCR：

第 1 步，cDNA 第二链的合成：52-60℃ 2分钟，72℃ 40 分钟（此步的目

地是合成第二链的 cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm

值决定，一般可以从 55℃开始）。

第二步 PCR 循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分钟，72℃ 3分钟，循环数

30。（此步为 PCR 扩增，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm

值决定，一般可以从 55℃开始）。

最后延伸：72℃ 15 分钟。

8. 取 5 μL PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认 PCR 扩增产物。若得到目的

扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可

按下列步骤进行巢式 PCR 反应。

四：利用基因专一性引物 B 和 3′ RACE 引物 C 进行巢式 PCR 反应

9. 将上轮 PCR 产物（4 管）用水稀释约 20 倍（在 50μL PCR 反应液中加入 1mL

超纯水），然后分别作为模板进行巢式 PCR 扩增。PCR 反应设置如下：

成分 1-4管

PCR MagicMix 3.0 各 25 μL

上步得到的PCR反应液（稀释20倍后） 4 种之一 1 μL

基因专一性引物 B（10 μM） 2.5 μL

3′ RACE 引物 C（10 μM） 2.5 μL

超纯水 补至 50 μL

10. PCR 反应。按下列条件进行 PCR：

第 1-30 次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分钟，72℃ 3分钟（复性温度需

要根据自备基因专一性引物 B 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃开始）。

最后延伸：72℃ 15 分钟。

11. 电泳检测。然后根据实验结果进行 DNA 测序或 TA 克隆