加T试剂盒

加T试剂盒

产品及特点某些 DNA 聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性，在只有 dTTP 存在的情况下，可以在平末端的 DNA 片段的两个 3’端各加上一个 dT 尾巴。本产品就是利用此原理开放的加 T 试剂盒，主要用于制备 T 载体或在平末端的 DNA 片段上加上 1 个 T 尾巴。

本产品具有下列特点：

1. 简单, 2X 加 T 预混合液中含有所需要的所有成分（包括酶）），不需要单独准备。

2. 各成分佳用量经过优化，用户不需要单独调试。

3. 适用于任何平末端的 DNA 片段，包括 Pfu DNA 聚合酶等高保真 DNA 聚合酶合成的 DNA 片段或限制性内切酶酶切回收得到的 DNA 片段。

4. 加 T 后的载体可以作为 T 载体使用。
规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装
2 X 加 T 预混液 LM60106a 1.25 mL（绿盖）
使用手册 LM60106sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂 平末端 DNA 片段、平末端质粒 DNA、自备超纯水。

使用方法 一：反应前纯化处理：

1. 平末端 DNA 片段或平末端质粒 DNA 可以采取胶回收和酚/氯仿抽提法等常规方法纯化，后溶解在水或 TE 中，终浓度以0.1 ug/uL 为宜。必须注意的是, 用 Vent, Deep Vent, Pfu,Pwo 等具有 3 到 5 外切活性的 DNA 聚合酶扩增得到的 DNA片段，必须经过彻底的去除残留的酶的处理过程（如酚/氯仿抽提或 Proteinase K 处理），否则它们将在加 T 反应时，将切除掉加上的 T 尾巴，干扰反应。

2. 本产品的加尾酶在 DNA 的 3’末端的核苷酸为 T 时，加 T 效率更高，故如果有可能，好满足此要求。

二：加 T 反应

3. 在干净的 0.5 mL 或 1.5 mL 离心管中，分别加入回收的 DNA20190124dx片段(0.2-2 ug)、25 uL 2 X 加 T 缓冲液、后补水到 50 uL，在 PCR 仪上 72℃保温 2 小时。如果用金属浴或水浴，必须加50uL 石蜡油，否则水分在反应过程中将蒸发，影响加尾效率。

4. 加 T 反应后，加尾酶将与 DNA 末端紧密结合，所以必须酚/氯仿抽提去除。如果使用 Proteinase K 处理后再用酚/氯仿抽提效果会更好。得到的 DNA 溶于适量水和 TE 中后即可用于后续连接反应。由于加一个 T 不会改变 DNA 片段的琼脂糖电泳速度，故不能通过跑电泳检测加尾效果。