DNA Shuffling试剂盒

DNA Shuffling试剂盒
产品及特点DNA Shuffling 即 DNA 分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术，它以一个或多个基因为起始材料，通过先随机断裂成小片段，再进行互为模板和引物的 PCR（无外加引物），最后再进行常规PCR（外加引物）等处理，最后得到含有大量 DNA 重组突变的 PCR 产物。其原理示意图如下：

本产品就是根据上述原理优化改进而成，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板，无需单独准备各成分。

2. 可以用于对长度在 1000bp 的同源片段进行 shuffling。

3. 操作手册经过优化，1-2 天即可完成，节省大量优化时间。

4. 本产品足够 10 次 DNA Shuffling 反应，只适用于科研，不能用于临床。
规格及成分 成分 编号 十孔盒包装
PCR MagicMix 90805 1 mL×3
DNase I 溶液（0.1U/μL） 90903a 10 μL
DNA Shuffling 试剂盒溶液 A，10× 131178a 100 μL
DNA Shuffling 试剂盒溶液 B，10× 131178b 100 μL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 131178sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

自备试剂 待突变基因片段、DNA Shuffling 引物（第二轮 PCR 引物）、胶回收试剂盒。

使用方法 

1. 提前开启 37℃和 75℃水浴或金属浴。

2. 待突变基因片段的制备：待突变基因片段可以用多个含同源片段的质粒为模板、用 PCR 法或酶切法制备。制备时需保证含起始同源片段（或此同源片段的一部分）的 DNA 片段总长度要比 DNA shuffling 终产物（第二轮 PCR产物）长 200-400 bp，即第二轮 PCR 的引物位置要在此步模板制备引物内侧 100-200bp，第二轮 PCR 产物的长度在 1000bp 以下。每次 DNAShuffling 实验至少需要 2 μg 起始同源片段（如果含两个以上同源片段，则彼此的比例为 1:1:1），最多可以使用 5 μg 起始同源片段，并且必须通过胶回收的方法回收，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等（如果不去除此步的引物，其将对后续 PCR 造成严重干扰）。最后需用分光光度法准确定量，此溶液即为同源片段，放冰上待用。

3. 准备 DNase I 工作液，将 1 μL 本试剂盒提供的 DNase I 溶液、8uL 超纯水、1 μL DNA Shuffling 试剂盒溶液 A 混合得 DNase 工作液，放冰上待用。DNase 工作液必须现配现用。

4. 设置同源片段碎片化反应：在一个 PCR 管中，按顺序加入下列成分：

成分 用量

同源片段（来于两个以上不同基因） 2-5 μg

DNA Shuffling 试剂盒溶液 A，10× 5 μL

DNA Shuffling 试剂盒溶液 B，10× 5 μL

DNase 工作液 2 μL

补超纯水到 50 μL

5. 充分轻柔吹打混匀后 37℃水浴 8 分钟，然后立即放 75℃水浴处理 10 分钟以灭活 DNase I。

6. 在 2-3%琼脂糖凝胶上电泳，用常规的胶回收法回收 25-150 bp 范围的所有片段，分光光度法精确测定回收片段的浓度。此即为回收片段，放冰上待用。注意：一定要加合适的 DNA marker 以便确定片段范围。

7. 回收片段重组反应：在一干净 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCRMix 3.0、补加超纯水到 100 μL。反应总体积为 100 μL

8. 按下面的 PCR 反应参数进行轮无引物 PCR：

过程 温度 时间

PCR 前变性 94℃ 150 s

PCR 反应

（40 循环）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 10 s，每次循环后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

9. 取 5-10 μL 进行电泳检测（本 PCR Mix 含上样成分，可以直接上样。红色示踪剂的泳动速度相当于 50bp DNA），然后对预期长度区域的 PCR 产物进行回收（如果 Shuffling 的同源区域长度为 800bp，则回收 600-1000bp范围的片段），得到轮 PCR 回收产物。

10. 留部分轮 PCR 回收产物之后，用超纯水将其分别稀释 10 倍、20 倍和50 倍，放冰上待用。

11. 取轮 PCR 回收产物原液、10 倍稀释液、20 倍稀释液和 50 倍稀释液各 1uL 作为 PCR 模板，按下表设置 4 管第二轮 PCR 反应（100μL 体系）。

成分 1-4 号管

PCR 模板（4 种） 各 1 μL（1 号加原液、2 号加 10

倍稀释液、以此类推）

PCR MagicMix 3.0 50 μL

自备 DNA Shuffling 引物 每管各加 30 pmol

超纯水 加到 100 μL

12. 按下列 PCR 参数进行 PCR：

过程 温度 时间

活化 94℃ 150 s

PCR 反应

（25 次循环）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 60 s，每次循环后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

13. 电泳检测 4 个 PCR 产物，回收预期大小的 PCR 产物（根据引物位置估计预期大小），用于后续克隆和分析实验（略）。