一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装

一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装
产品及特点尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离 200 nt 以下的小片段 RNA，尤其是 20 nt 左右的 microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配 制各种溶液十分繁琐，为此天泽基因开发了本产品。它具有下列特点:

1. 一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实 验人员称取有毒物品。

2. 灵活，可以根据需要配制各种浓度的 Urea-PAGE，以便对长度各异的 RNA 进行电泳。

3. 电泳后可直接用于 UV 观察、银染、胶回收、Northern 杂交等实验。

4. 使用新型缓冲液，可以防止甘油的干扰。 
一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装
规格及成分 成份 编号 大纸盒包装
运输及保存 尿素 100873 210 g RT 丙烯酰胺 100864 60g，用 250mL 瓶 RT 甲叉双丙烯酰胺 100877 3g RT TBE 电泳液, 10× 90313 250 mL RT TEMED 110-18-9 1.5 mL RT 过硫酸铵 100879 1 g RT miRNAON 70608 1.5 mL 低温/-20℃ miRNA Marker 70605 150 uL 低温/-20℃ 固相 RNase 清除剂 3090 250 mL RT 使用手册 70606sc 1 份 RT

一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装运输及保存 常温运输和保存，miRNAon、miRNA Marker 需要低温运输，-20℃保存， 保存期一年。自备试剂 miRNA 样品、RNase-free 水。 

使用方法1. 准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁工作平台 直接将固相 RNase 清除剂原液或 10 倍的新鲜稀释液喷于台面，5 分钟后 用普通吸水纸擦净，最后用沾有固相 RNase 清除剂 1000 倍新鲜稀释液的 吸水纸擦净，晾干。

2. 准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁玻璃和塑料器皿 将器皿浸泡在固相 RNase 清除剂的 10 或 100 倍的新鲜稀释液中，静置 处理 5 分钟后取出，再用固相 RNase 清除剂 1000 倍或 10000 倍新鲜稀 释液浸泡二次以上，倒立晾干后备用。 

3. 配制 1×TBE 电泳液: 将适量的 10×TEB 电泳液用 RNase-free 水稀释 10 倍，得到 1×TBE 电泳液待用。此溶液需要现用现配，否则易长菌。

4. 配制 10%过硫酸铵溶液: 精确称取100 mg 过硫酸铵到一干净的 1.5 mL 离心管中，按每 1 mg 过硫酸铵加 10 μL RNase-free水的比例加入 RNase-free 水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不超过一周。

5. 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块 13 cm×15 cm× 0.8 mm 的胶需要 15 mL 凝胶溶液，配制一块 36 cm×45 cm×0.8 mm 的胶需 要 120 mL 凝胶溶液。

6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将 3g 甲叉双丙烯酰胺加入到 装有 60g 丙烯酰胺干粉的瓶中，再加入 130 mL RNase-free 水，充分摇 晃混匀即得 40%的 Acrylamide/Bis 溶液。

7. 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分

8. 搅拌并加热到 40-50℃左右，直到尿素完全溶解。

9. 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理 10-15 分钟以充分去除 溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。

10. 边摇晃溶液变加入 50 μL TEMED 和 500 μL 10%过硫酸铵。注意：如果 选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改 变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。

11. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟
等待胶凝固。

12. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲 液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。

13. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

14. 在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可 以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。

15. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNAon 混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放 置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。miRNA Marker 需要每个 上样孔用 5μL，一块胶在两侧各用一个孔上样 miRNA Marker。

16. 关电泳仪后开始上样。

17. 重开电泳仪，对 13 cm×15 cm 的胶，以 20-30mA 的电流电泳，直到红 色染料移动到凝胶边缘为止；对36 cm×45 cm 的胶，则以 50-60mA 的 电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。

18. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的 凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10mg/mL 的 EB 溶液）、天泽基因低毒核 酸染料 DNAgreen（每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL DNAgreen 原 液）。 UV 下观察并拍照。

19. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后进行胶回收处理。

20. Northern 杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。

21. 放射自显影：如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的 玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保 鲜膜，真空抽干，然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。