ssDNA/RNA 环化连接酶

ssDNA/RNA 环化连接酶为热稳定的DNA/RNA连接酶，不依赖于ATP，可催化单链DNA或单链RNA的环化，也可催化其分子间连接，但其对单链DNA的连接效率更高。环化反应中，要求催化底物单链DNA/RNA具有5’-磷酸基团和3’-OH基团。对于大于15nt的单链底物，该酶都能高效的连接。该酶还可催化DNA或RNA分子与预腺苷化的DNA接头之间的连接，另外，在ATP过量的情况下，该酶可使DNA/RNA分子腺苷化。

组分

组分名称 数量
ssDNA/RNA CircLigase (100 U/μl) 20 μl
10×CircLigase Buffer 250 μl
50mM MnCl2 100 μl

活性定义

60°C 1h条件下，催化1pmol 5’-磷酸化参照Oligo (55mer)完全环化所需的酶量定义为1U。

储存

-20℃可保存3年。

使用注意事项

1. 1×CircLigase Buffer: 30mM Tris-acetate (pH 7.5), 60mM potassium acetate, 1mM DTT。
2. 添加终浓度50μM的ATP可提高环化效率，高于1mM ATP浓度会抑制连接反应。
3. 对于单链DNA产物的连接，需要加入终浓度2.5mM MnCl2。
4. 5’端未磷酸化的底物不能用于连接，3’端无-OH的底物不能用于连接。
5. 对于含有二级或复杂结构的连接底物，可加入0.4~0.8 M Betain以提高连接效率。
6. 该酶对底物碱基具有选择性，5’末端连接效率: G > A >>> T (U)>>> C，3’末端连接效率T(U) > A > G，当3’端的碱基为C时不能用于连接，几乎无连接产物。

实例

[ssDNA环化连接酶]
应用ssDNA/RNA环化连接酶环化52nt的单链DNA分子后PAGE凝胶电泳，泳道1为未加环化酶，2为加入环化酶，3为环化产物加入ExoI酶消化产物。