Co-IP与GST Pull-down蛋白质互作实验服务

Co-IP（Co-Immunoprecipitation，即免疫共沉淀实验）与GST Pull-down（GST融合蛋白沉降技术）是两种常用的检测蛋白质分子间相互作用的技术，使用对应的固相基质来沉淀诱饵蛋白及目的蛋白，然后通过蛋白印迹(westernblot，WB)技术对蛋白质沉淀进行检测，验证蛋白之间是否存在相互作用。

技术介绍

Co-IP：

该实验使用偶联有Protein A/G的琼脂糖珠或磁珠（Protein A/G能够特异性结合免疫球蛋白）特异性结合诱饵蛋白的抗体，以此捕获诱饵蛋白。当体系中存在能够与诱饵蛋白相互作用的目的蛋白时，目的蛋白会与琼脂糖珠或磁珠上的诱饵蛋白结合，并在重力（琼脂糖珠）或磁力（磁珠）的作用下沉淀下来。

然后通过蛋白印迹(westernblot，WB)技术分别使用诱饵蛋白抗体和目的蛋白抗体对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测到沉淀中同时存在诱饵蛋白和目的蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用。

Co-IP原理示意图

GST pull-down：

GST，全称glutathione-S-transferase，即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，能够和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）稳定结合，将GSH与琼脂糖珠/磁珠交联可得GSH琼脂糖珠/磁珠。

该实验中使用带有GST标签的诱饵蛋白，可以结合到GSH琼脂糖珠/磁珠上。当体系中存在能够与诱饵蛋白相互作用的目的蛋白时，目的蛋白会与GSH琼脂糖珠/磁珠上的诱饵蛋白结合，从而在重力（琼脂糖珠）或磁力（磁珠）的作用下沉淀下来。

然后通过蛋白印迹(westernblot，WB)技术分别使用GST抗体和目的蛋白抗体对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测到沉淀中同时存在带有GST标签的诱饵蛋白和目的蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用。

GST Pull-down原理示意图

实验流程简介

Co-IP实验流程：

1 蛋白样品的制备

2体系孵育

3免疫共沉淀

4洗涤

5洗脱

6 WB检测或其他方式检测

GST Pull-down实验流程：

1蛋白样品的制备

2体系孵育

3 GST Pull-down

4 洗涤

5 洗脱

6 WB检测或其他方式检测

实验结果解析

Co-IP文献案例

来源：https://www.nature.com/articles/s41418-024-01367-6/figures/1

该图为验证蛋白NLRP3与蛋白GSN之间是否存在互作的结果图。

实验中NLRP3蛋白带有FLAG标签，GSN蛋白带有Myc标签。

Input：

Flag代表以Anti-Flag抗体对样本进行WB检测，条带4处空白，表示该样本中不存在Flag-NLRP3，条带5、6表示两个样本中都存在Flag-NLRP3；

Myc代表以Anti-Myc抗体对样本进行WB检测，条带1、2两处空白，表示这两个样本中不存在Myc-GSN，条带3表示该样本中都存在Myc-GSN。

(Input部分检测的是未经过IP处理的样本，显示各组中的样本成分，同时作为阳性对照。)

IP：

IP:Flag表示该实验是用Flag-NLRP3作为诱饵蛋白，以Anti-Flag抗体作为诱饵蛋白抗体进行IP实验，目的蛋白是Myc-GSN；

Flag代表以Anti-Flag抗体对IP后的样本做WB检测，Myc代表以Anti-Myc抗体对IP后的样本做WB检测，条带8处的空白表示Anti-Myc抗体不会与Flag-NLRP3结合，而条带9、12则表示沉淀中同时存在Flag-NLRP3和Myc-GSN，说明当体系中存在Flag-NLRP3时，对其进行免疫沉淀，Myc-GSN会被共沉淀下来。

综上所述，可以验证蛋白NLRP3与蛋白GSN之间存在互作。

GST Pull-down文献案例

来源：https://www.nature.com/articles/s41467-024-51020-6/figures/2

该图为验证Pnsll和Pelo的之间是否存在互作的GST Pull-down结果图。

蛋白Pnsll带有GST标签，蛋白Pelo带有His标签。

Input：

Anti-His代表以Anti-His抗体对样本进行WB检测，条带1、2表示两个样本中都存在His-Pelo；

Anti-GST代表以Anti-GST抗体对样本进行WB检测，条带5、9表示该样本中存在GST-Pnsll，不存在GST；条带6、10表示，该样本中存在GST，不存在GST-Pnsll；

Pull-down：

该实验使用GST-Pnsll作为诱饵蛋白进行Pull-down实验，His-Pelo则作为目的蛋白；

此时Anti-GST、Anti-His代表分别以Anti-GST抗体和Anti-His抗体对Pull-down处理后的样本进行WB检测，条带4处的空白表示GST不会与His-Pelo结合，而条带3、11则表示沉淀中同时存在GST-Pnsll和His-Pelo，说明当体系中存在GST-Pnsll时，通过GST Pull-down就能将His-Pelo“拉”下来。

综上所述，可以验证蛋白Pnsll与蛋白Pelo之间存在互作。

样本类型及需求量

后续如果需要进行质谱分析，样本量建议翻倍；

上表为单组实验所需送样量，如果需要进行对照实验，样本量建议翻倍；

样本置于1.5ml或其它型号的低吸附离心管里；

管上清楚标明样本名称，样本管上的名称需清晰明确，请核实无误；

用封口膜把样本管缠紧密封好；

将样本管置于保护用的50ml离心管或其它容器里，用适量纸、纱布或棉花塞紧，防止样本管晃荡。

服务项目

验证蛋白质间相互作用的Co-IP检测；

验证蛋白质间相互作用的GST Pull-down检测。