PLA邻位连接技术

细胞内蛋白相互作用：PLA邻位连接技术

摘要：邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种高灵敏度、高特异性检测蛋白质相互作用和修饰的技术。该技术结合了抗体识别与DNA连接及扩增技术，实现了对蛋白质近距离事件的精准检测。本文系统介绍了PLA的实验原理、操作流程及其广泛的应用领域。

1. PLA技术介绍

邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种高灵敏度的蛋白质相互作用检测方法。它利用特异性抗体结合目标蛋白，这些抗体连接着不同的DNA探针。当目标蛋白相互靠近时，DNA探针也随之邻近。DNA连接酶将邻近探针连接成完整模板，滚环扩增（RCA）技术扩增模板产生大量单链DNA，荧光标记探针检测和定量这些产物，显著放大信号，使微弱相互作用可检测。PLA技术在生物医学研究中广泛应用，包括蛋白质相互作用研究、修饰分析、药物研发等领域。

     2. PLA技术原理

PLA技术通过特异性抗体结合目标蛋白，这些抗体连接着不同DNA探针。当目标蛋白相互靠近时（＜40 nm），DNA探针也随之邻近。加入DNA连接酶后，邻近探针连接形成完整DNA模板。随后，滚环扩增（RCA）技术扩增该模板，产生大量单链DNA产物，荧光标记寡核苷酸探针可检测和定量这些产物。RCA显著放大信号，使微弱分子相互作用可检测。每个蛋白相互作用事件生成多个荧光信号点，灵敏度显著提高（见图1）。荧光显微镜下，信号点对应目标蛋白相互作用位置（Tanabe et al., 2015；Wang et al., 2021）。

PLA技术由瑞典科学家Ulf Landegren教授的学生Simon Fredriksson博士开发，用于检测PDGF-BB水平，首次将DNA连接和扩增技术与抗体识别结合用于蛋白质相互作用检测，为技术发展奠定基础（Fredriksson et al., 2002）。后续该团队推动技术进步，使其应用于固定细胞或组织中的蛋白质及其相互作用检测，并开发了商业化试剂盒（Gullberg et al., 2004；Söderberg et al., 2006；Klaesson et al., 2018）。

图1 邻位连接技术原理（Tanabe et al., 2015）

     3. 实验流程

PLA技术是一种高灵敏度的蛋白质相互作用检测方法，通过DNA连接和扩增将蛋白质相互作用转化为可检测的荧光信号（见图2）。其步骤简述如下：

（1）样品制备：对细胞或组织进行固定和透化处理，以便抗体能够进入并结合目标蛋白，同时通过封闭非特异性结合位点来减少背景信号。

（2）抗体孵育：使用来自不同物种的特异性一抗结合目标蛋白后，再使用带有DNA探针的二抗与一抗结合。

（3）连接反应：加入DNA连接酶，将相邻的DNA探针连接成环状或线性模板。

（4）滚环扩增（RCA）和荧光标记：在含有荧光染料的缓冲液中，利用聚合酶对模板进行滚环扩增（RCA），同时生成带有荧光标记的DNA产物。

（5）信号检测：在荧光显微镜下观察产生的荧光信号，以定位蛋白质相互作用的区域。

（6）数据分析：通过分析荧光信号的数量、位置和强度，评估蛋白质之间的相互作用（Debaize et al., 2017）。

图2 PLA实验基本流程（Debaize et al., 2017）

      4. 技术优势

邻位连接技术（PLA）结合了高特异性、高灵敏度和空间分辨率，具有以下独特优势，相较于Co-IP、FRET、BiFC等其他蛋白互作检测技术：

（1）单分子水平检测，高灵敏度

PLA能够检测低丰度蛋白的相互作用或修饰，甚至在单个细胞中识别单一分子事件。与传统的Co-IP相比，PLA不依赖于高表达或大量样品，具有更高的灵敏度。

（2）细胞内原位检测，保留空间信息

PLA可以直接在细胞或组织内观察蛋白相互作用的空间定位，保留蛋白的生理背景。这是像Western blot等裂解依赖方法无法实现的，尤其适用于研究细胞亚结构特异性的互作，如线粒体、核膜和胞质颗粒等。

（3）高特异性检测近距离接触的蛋白相互作用

PLA依赖于抗体探针间的空间接近（通常<40 nm），相比于共定位（共聚焦显微镜分辨率约100-200 nm），其对物理接触的蛋白相互作用具有更高的特异性，显著降低了虚假共定位的概率。

（4）可实现定量分析

PLA通过显微镜计数荧光点数进行相对定量分析。与FRET等只能提供信号强度的技术不同，PLA能够进行逐点统计并进行详细的图像分析。

（5）无需荧光蛋白融合，适用于内源蛋白

PLA仅依赖高质量的抗体来识别内源蛋白，无需构建融合蛋白，避免了人工标签可能引起的构象干扰或非生理表达导致的伪互作。此特点使其适用于临床样本和原代细胞研究。

    5. 经典案例分享

案例1：USP9X与HIF-2α/SOX2的相互作用分析

2025年，四川大学华西医院刘伦旭团队发表论文《RNase1-driven ALK-activation is an oncogenic driver and therapeutic target in non-small cell lung cancer》中，通过PLA邻位连接技术研究RAGE与RNase1和ALK之间的相互作用。结果显示，RAGE与RNase1和ALK之间均产生了显著的PLA信号，表明这三种蛋白在细胞内可形成空间邻近的复合体（Zha et al., 2025）。

图4 PLA实验结果（图片来自原文Fig.1）

案例2：USP9X与HIF-2αh和SOX2之间的相互作用分析

天津医科大学肿瘤医院等单位在论文《USP9X integrates TGF-β and hypoxia signalings to promote ovarian cancer chemoresistance via HIF-2α-maintained stemness》中，通过PLA邻位连接技术研究了USP9X与HIF-2αh和SOX2之间的相互作用。研究者采用抗USP9X和抗HIF-2α/GAPDH抗体对HIF-2α过表达的OVCA8细胞进行PLA实验，证实了USP9X与HIF-2α在细胞核内存在相互作用，且TGF-β和低氧条件显著增强了这种相互作用。此外，利用抗USP9X和抗SOX2抗体进行的PLA实验显示，USP9X与SOX2在细胞核中共定位，这一现象在TGF-β和低氧处理后更加明显（Zhang et al., 2025）。

图5 PLA实验结果（图片来自原文Fig. 3）

   6. 所需样品清单

6.1 样品需求

（1）细胞样品

Ÿ 细胞悬浮液：提供≥1×10⁶个细胞，密度约1×10⁶ cell/mL；

Ÿ 细胞爬片：8～10张，Φ12-15 mm爬片；

为了确保您提交的细胞样品在我们实验室中可以顺利用于PLA（Proximity Ligation Assay）实验，并获得可靠稳定的结果，请按照免疫荧光（Immunofluorescence，IF）实验的要求制备样品，或根据《7. PLA细胞样品准备指南》选择制备细胞样品方式。

（2）抗体

Ÿ 提供蛋白对应的一抗，每种抗体≥50 μg；

Ÿ 一对互作蛋白的2个抗体须分别来自兔和鼠两个不同物种（仅要求物种来源，无需针对特定抗原配对）；

Ÿ 未标记抗体（不可带有荧光、HRP标签）；

Ÿ 推荐IF/IHC实验验证过的一抗。

（3）样本信息表

包括细胞类型、抗体组合设计等。

6.2 实验周期

收到样品后15～20个工作日完成实验及数据交付。

6.3 交付内容

完整的PLA原始图像数据、PLA分析报告以及荧光图像标注图。

     7. PLA细胞样品准备指南

7.1细胞悬浮液

（1）细胞消化（贴壁细胞）：使用0.25%胰酶处理，液量覆盖细胞，室温孵育30秒至2分钟，视细胞类型调整时间。细胞脱落后立即终止消化。

（2）终止与回收：加入含10% FBS的培养基终止胰酶反应，吹打底部形成细胞悬液。

（3）洗涤（悬浮细胞从此步骤开始）：用PBS洗涤细胞2次，800 g离心5分钟。

（4）固定：用4%多聚甲醛（PFA）溶液悬浮细胞，室温下静置15分钟，不时摇动。

（5）洗涤：800 g离心5分钟，用PBS重悬细胞，重复洗涤细胞2次。

（6）重悬：800 g离心5分钟，用PBS重悬细胞，使每管细胞密度约≥1×10⁶ cell/mL。

（7）包装与运输：使用密封离心管盛装细胞悬液，贴好标签（如细胞名、数量、日期）。放入带有冰袋的泡沫保温箱中运输，全程维持4℃冷藏，但冰袋与细胞不直接接触。建议48小时内送达。

7.2细胞爬片和滴片

（1）爬片准备：每组实验条件建议提供4～6片Φ12-15 mm的爬片或滴片。对于悬浮细胞，需使用多聚赖氨酸（poly-L-lysine，PLL）处理的玻片，以促进细胞黏附。可以使用市售预处理爬片。

（2）细胞数量：每片爬片约含1-2×10⁴个细胞，总细胞数不少于1×10⁶。

（3）细胞接种：将无菌爬片放置于培养板（如24孔板）中，加入细胞悬液使其均匀分布，黏附于爬片表面。建议每孔接种1-2×10⁵个细胞，避免过密或过稀。对于悬浮细胞，可将PLL处理的爬片置于培养板中，滴加调整好浓度的细胞悬液，室温静置30～60分钟使其黏附，必要时可低速离心（200 g，3～5分钟）辅助沉降。

（4）固定处理：细胞生长至适宜密度后，加入4%多聚甲醛（PFA）室温固定15分钟。固定结束后立即吸去固定液。

（5）清洗与保存：用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，去除残留固定剂。洗涤后在每片爬片上加入PBS保持湿润，防止干片。

（6）包装与运输：使用密封离心管盛装细胞悬液，贴好标签（如细胞名、数量、日期）。放入带有冰袋的泡沫保温箱中运输，全程维持4℃冷藏，但冰袋与细胞不直接接触。建议48小时内送达。

       8. 相关技术服务

参考文献

[1] Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Ostman A, Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 2002 May;20(5):473-7. PMID: 11981560.

[2] Gullberg M, Gústafsdóttir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegård M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 1;101(22):8420-4.

[3] Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 2006 Dec;3(12):995-1000.

[4] Klaesson A, Grannas K, Ebai T, Heldin J, Koos B, Leino M, Raykova D, Oelrich J, Arngården L, Söderberg O, Landegren U. Improved efficiency of in situ protein analysis by proximity ligation using UnFold probes. Sci Rep. 2018 Mar 29;8(1):5400.

Tanabe M, Ishino Y, Nishida H. From Structure-Function Analyses to Protein Engineering for Practical Applications of DNA Ligase. Archaea. 2015 Oct 5;2015:267570.

[5] Wang P, Yang Y, Hong T, Zhu G. Proximity ligation assay: an ultrasensitive method for protein quantification and its applications in pathogen detection. Appl Microbiol Biotechnol. 2021 Feb;105(3):923-935.

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