T4 RNA连接酶1(ssRNA连接酶)

基本信息‌

‌英文名称‌：T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)
作用机制：催化单链RNA分子之间的连接，或单链RNA与单链DNA分子之间的连接；需要ATP作为能量来源，可实现RNA分子的末端连接、环化等反应。 

适用样本：RNA分子的连接、环化、RNA文库构建等实验，适用于RNA沉默、基因调控等研究。
产品概述
T4 RNA连接酶1（ssRNA连接酶）是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离得到的一种RNA连接酶，主要用于催化单链RNA分子之间或单链RNA与单链DNA分子之间的连接。它能够识别RNA或DNA分子的5'磷酸基团与3'羟基，并催化形成磷酸二酯键，可将不同的单链核酸分子连接起来，或使单链RNA分子自身环化。T4 RNA连接酶1需要ATP作为能量辅助因子，在合适的缓冲体系与温度条件下可高效进行连接反应。它在分子生物学研究中有广泛应用，如RNA测序文库构建、RNA修饰研究、RNA探针标记、RNA结构与功能研究、RNA干扰（RNAi）实验等。该酶具有高特异性与高活性，为RNA分子的修饰与重组提供了重要的工具。
产品特点
底物特异性强：专门催化单链RNA分子间或RNA与DNA分子间的连接，对单链RNA的连接效率尤为突出。

反应条件温和：在常温（16-37℃）下即可高效催化反应，无需高温处理，保护核酸分子完整性。

连接机制独特：需要ATP作为能量辅助因子，形成酶-AMP中间体后催化磷酸二酯键形成。

应用场景丰富：可用于RNA环化、RNA标记、RNA文库构建、RNA适配体筛选等多种实验。

产物纯度高：连接产物无冗余序列，可直接用于后续的RT-PCR、qPCR或测序实验。
操作步骤

样本处理：向1.5ml EP管中加入600μl miRNA提取试剂，再加入500μl血清或血浆样本，漩涡振荡30秒充分混匀

初步分离：13000rpm离心5分钟，将上清约1ml转移至新的2ml EP管中，加入1ml异丙醇，上下颠倒混合均匀

柱式吸附：将混合液分三次加入吸附柱（每次约700μl），13000rpm离心15秒，倒掉过柱液

洗涤纯化：

向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液

向吸附柱中加入500μl无水乙醇，13000rpm离心15秒，倒掉过滤液

干燥柱体：吸附柱13000rpm空离心2分钟，去除残留乙醇，室温放置2分钟使乙醇完全挥发

RNA洗脱：在吸附柱滤芯中央加入30μl RNase-Free TE缓冲液，室温静置2分钟，13000rpm离心2分钟，收集滤液即为提取的miRNA产物

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注意事项

样本处理：

血浆抗凝剂建议使用EDTA或柠檬酸钠，避免使用肝素（会抑制PCR检测）

样本应避免反复冻融，新鲜样本建议尽快处理

试剂使用：

miRNA提取试剂含有胍盐，具有强烈腐蚀性，操作时需佩戴防护眼镜、手套和口罩

自备试剂需确保无RNase污染，避免影响RNA完整性

实验操作：

所有操作需在无RNase环境中进行，使用RNase-Free的枪头和离心管

离心过程需确保离心管盖紧，避免液体渗漏

产物检测：

由于血清/血浆中miRNA含量极低，提取产物浓度通常在5ng/μl以下，难以用常规NanoDrop测量，建议直接取10μl进行下游反转录实验

为获得更可靠数据，推荐使用特异性和灵敏度更好的TaqMan探针法进行miRNA定量检测

产物保存：提取的miRNA产物可立即用于下游实验，或分装后置于-80℃长期保存，避免反复冻融