兔外周血树突状细胞 (未成熟DC细胞)

方法简介  实验室分离的兔外周血树突状细胞 (未成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔外周血树突状细胞 (未成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔外周血树突状细胞 (未成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔外周血树突状细胞 (未成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：2-3月龄新西兰大白兔，体重2.0-2.5kg，每只可获得1.5-3.0×10⁶个细胞，活力>88%

试剂：0.125%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、DNase I、BSA、MEM培养基

分离纯化步骤

外周血经肝素抗凝处理后，用红细胞裂解液处理去除红细胞，400g离心10分钟收集白细胞沉淀

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

细胞沉淀重悬于含10% FBS的培养基中，经Ficoll密度梯度离心进一步纯化目标细胞

原代培养要点

细胞悬浮于完全培养基中，按1-5×10⁵ cells/mL密度接种于24孔板，37℃、5% CO₂培养箱悬浮培养

悬浮培养条件下细胞活性保持稳定，每2天半量换液维持细胞密度

常见问题优化

目标细胞占比低：优化Ficoll梯度离心条件，改进密度梯度分离策略

细胞活化状态改变：缩短体外培养时间，避免过度刺激导致细胞表型改变

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰蛋白酶）、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取外周血组织。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的目标组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化44min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤网过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除未消化组织块。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME调整细胞浓度至140000.0cells/mL，接种于预涂未涂层的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天更换新鲜培养基，倒置显微镜下观察细胞贴壁及悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强。