小鼠骨骼肌微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠骨骼肌微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠骨骼肌微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠骨骼肌微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠骨骼肌微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：8周龄SPF级C57BL/6J小鼠，体重20-28g，每只可得0.5-1.0×10⁶个目标细胞，活力>90%

试剂：中性蛋白酶、胶原酶D、DNA酶I、Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS、DMEM/F12完全培养基

分离纯化步骤

组织取材后迅速放入预冷PBS中转运，无菌操作下剔除周围组织，剪碎后加入中性蛋白酶、胶原酶D、DNA酶I、Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS于37℃消化120-180分钟

滤过70目滤网后的细胞悬液加入等体积含10% FBS的培养基终止消化，500g离心12分钟

采用预混合抗体标记+磁珠分选策略，特异性富集目标细胞，纯度>80%

原代培养要点

调整细胞浓度至2×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

内皮细胞生长需要较高的血清浓度和血管内皮生长因子支持，注意维持培养基新鲜度

常见问题优化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS液、胶原酶Ⅰ+Dispase II混合消化液、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取肌肉组织，冰预冷PBS液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入胶原酶Ⅰ消化液，37℃水浴消化30min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至胶原预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2-3天换液一次，定期倒置显微镜观察鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰及生长情况。