小鼠脊髓微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脊髓微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脊髓微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠脊髓微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脊髓微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8周龄BALB/c小鼠，体重20-25g，单只取材获0.4-0.9×10⁶个细胞，活率>88%

试剂：0.125%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、DNase I、BSA、IMDM培养基

分离纯化步骤

组织取材后迅速放入预冷PBS中转运，无菌操作下剔除周围组织，剪碎后加入0.125%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、DNase I、BSA于37℃消化30-60分钟

滤过100目滤网后的细胞悬液加入等体积含10% FBS的培养基终止消化，400g离心10分钟

采用预混合抗体标记+磁珠分选策略，特异性富集目标细胞，纯度>90%

原代培养要点

调整细胞密度至3×10⁴接种于预处理培养皿，37℃、5% CO₂培养箱培养

内皮细胞生长需要较高的血清浓度和血管内皮生长因子支持，注意维持培养基新鲜度

常见问题优化

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

目标细胞占比低：优化消化条件提高目标细胞得率，改进分离策略减少非目标细胞污染

细胞生长缓慢：检查血清批次质量，补充必要生长因子，确保CO₂浓度和温度稳定

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS液、Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶混合消化液、Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取脑组织，冰预冷PBS液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入Ⅳ型胶原酶消化液，37℃水浴消化36min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至明胶预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每3天换液一次，定期倒置显微镜观察多突起状，贴壁生长，可见神经突延伸及生长情况。