人骨骼肌成纤维细胞

人骨骼肌成纤维细胞

实验选用手术废弃组织，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经组织块贴壁法获取原代成纤维细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用含血清的基础培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用ELISA检测Fibronectin阳性表达率，线粒体膜电位检测定量Thy-1表达量，结合克隆形成实验分析下游通路蛋白表达变化，并通过氧化应激实验验证细胞生物学活性。

产品名称：人骨骼肌成纤维细胞

英文名称： Human Skeletal Muscle Fibroblasts

组织来源： 骨骼肌组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人骨骼肌成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人骨骼肌成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人骨骼肌成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人骨骼肌成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS缓冲液、消化液（胶原酶Ⅰ+Dispase II）+透明质酸酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取肌肉。

2. 置于冰预冷PBS缓冲液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的肌肉组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅰ+Dispase II+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化38min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用差速贴壁法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至130000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及长梭形或纺锤形，贴壁生长，细胞核大而圆，核仁明显。

取材前动物需禁食12小时，手术切除法处死后立即取骨组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致骼肌成纤维贴壁不良和形态异常。

该细胞具有贴壁生长特性，培养过程中需维持培养基pH在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜培养基，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化。

培养体系中必须补充DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

换液前先用倒置显微镜观察细胞贴壁情况和形态特征，确认无污染后缓慢吸除旧培养基，沿壁缓慢加入预热的新鲜培养基，避免直接冲洗细胞层。