人肺微血管内皮细胞

人肺微血管内皮细胞

取材自伦理批准的人源组织的微血管组织，经胶原酶IV消化获取原代内皮细胞，接种于胶原预包被培养皿中，采用MEM基础培养基培养；通过共聚焦显微镜观察鉴定CD34表达特征，划痕愈合实验检测Tie-2表达水平，并采用空间转录组学评估细胞功能状态。 细胞形态经倒置显微镜观察符合内皮细胞典型形态特征。

产品名称：人肺微血管内皮细胞

英文名称： Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (HPMEC)

组织来源： 肺组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人肺微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人肺微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人肺微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人肺微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS缓冲液、Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶混合消化液、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织）处理。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取肺组织，冰预冷PBS缓冲液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入Ⅳ型胶原酶消化液，37℃水浴消化30min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至胶原预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2-3天换液一次，定期倒置显微镜观察鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰及生长情况。

取材前动物需禁食12小时，手术切除法处死后立即取肺组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

培养皿需用胶原蛋白-I型(5μg/cm2)包被过夜，次日PBS洗涤3次后使用，未包被表面微血管内皮难以正常贴附和铺展。

该细胞贴壁生长，每2-3天换液一次，传代比例为1:2至1:3，过度传代(>P5)会导致细胞衰老和功能性下降。

培养基中应加入GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF，使用前需预热至37°C并预平衡CO2浓度至5%，血清批次更换前需进行预实验验证促生长效果。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。