小鼠胰腺星状细胞

方法简介  实验室分离的小鼠胰腺星状细胞采用胶原酶制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠胰腺星状细胞经α-SMA或Desmin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠胰腺星状细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠胰腺星状细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胰腺/睾丸/肾上腺等内分泌腺体

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标内分泌腺体组织，仔细去除周围结缔组织

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、45-60分钟)分散细胞

经滤网过滤后，采用密度梯度离心纯化目标细胞

胰岛细胞可采用Handy solution差速沉淀法进一步纯化

原代培养要点

胰岛beta细胞：使用CMRL-1640+10%FBS+10mM HEPES+50uM beta-巯基乙醇

睾丸间质细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+0.1% BSA培养

肾上腺皮质细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+0.1uM地塞米松培养

常见问题优化

胰岛细胞纯度不高：采用Handy solution梯度离心可获得纯度>90%的胰岛细胞

内分泌细胞功能维持：添加相应激素(如IGF-1、IGF-2)可维持细胞功能

细胞存活率低：培养基中添加抗坏血酸和转铁蛋白可提高存活率

无菌处死小鼠，消毒后解剖获取胰腺组织，预冷 PBS 反复冲洗，去除血液、脂肪组织，将胰腺放置于冰上无菌培养皿，全程低温降低细胞激活。

充分剪碎胰腺组织，加入胶原酶 IV+DNase I 混合消化液，37℃水浴消化 30min，间断轻柔摇晃，让消化液充分浸润全部组织碎块。

完全培养基中和消化反应，反复吹打组织，先后经 100μm、40μm 细胞筛过滤，去除大块组织残渣，收集全部过滤后的细胞悬液。

细胞悬液离心 1000r/min 5min，弃上清，PBS 重悬洗涤沉淀 2 次，去除消化酶残留，裂解去除红细胞，降低杂质干扰。

采用 Nycodenz 密度梯度离心分离胰腺星状细胞，制备分层分离液，铺加细胞悬液，梯度离心后吸取中间目标细胞层，PBS 洗涤去除分离液试剂。

胰腺星状细胞完全培养基重悬细胞沉淀，计数，调整接种密度接种于培养瓶，置于 37℃，5% CO₂培养箱孵育，静置不要频繁移动。

培养 24h 后更换全部培养基，去除悬浮死细胞；后续每 48h 换液，观察细胞由静息态向活化态转变，细胞汇合度达到 80% 即可传代，警惕上皮、腺泡杂细胞污染。