小鼠神经少突胶质前体细胞

方法简介  实验室分离的小鼠神经少突胶质前体细胞采用胰蛋白酶消化、混合细胞营养缺失培养、摇床振荡结合差速贴壁法并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠神经少突胶质前体细胞经A2B5免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠神经少突胶质前体细胞完全培养基(含B-27 Supplement、PDGF、bFGF、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2天半量换液1次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 双极、多极形

传代比例： 不传代

传代特性： 不传代，不增殖，存活1-2周

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠神经少突胶质前体细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

无菌前期准备：超净台紫外照射灭菌 30min，准备少突胶质前体细胞 OPC 专用无血清培养基、无菌 PBS、温和消化解离液、多聚赖氨酸包被培养器皿、无菌离心管；37℃水浴预热试剂，OPC 对环境变化敏感，培养容器提前包被多聚赖氨酸，全部耗材酒精消毒移入操作台。

冻存细胞复苏融化：液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃，1‑2min 融化冻存液；冻存管外壁酒精消毒移入超净台，细胞悬液转移至装有 OPC 完全培养基的离心管，轻柔混匀稀释 DMSO 毒性。

低速离心收集细胞沉淀：离心管配平，900r/min 离心 6min；离心结束，超净台缓慢吸弃上清，保留管底脆弱的少突胶质前体细胞沉淀，避免细胞丢失损伤。

轻柔重悬计数接种包被培养板：加入预热少突胶质前体细胞专用培养基，大口径枪头轻柔吹打沉淀制备单细胞悬液；细胞计数，调整接种密度，接种至多聚赖氨酸包被完成的培养板。

恒温 CO₂培养箱孵育贴壁：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 48h，减少移动培养板，等待细胞贴壁，观察胞体与细小突起生长。

半量换液维持前体细胞状态：48h 后进行半量换液，吸出一半旧培养基，补入同等体积新鲜预热 OPC 培养基，不彻底更换培养液，防止细胞分化凋亡；之后每 2‑3 天半量换液。

传代解离扩增或者诱导成熟分化：细胞增殖达到合适密度，收集细胞，温和酶解处理，吹打为单细胞，离心重悬重新接种包被培养板实现扩增；若需要诱导成熟少突胶质细胞，更换分化诱导培养基，用于髓鞘相关功能实验。