小鼠气管平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠气管平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合组织贴块法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠气管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠气管平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠气管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

环境与试剂预处理：超净台紫外照射消毒 30min，细胞专用完全培养基、PBS 缓冲液、胰酶消化液置于 37℃水浴复温，准备 T25 培养瓶，标注细胞信息，所有耗材试剂酒精擦拭后移入无菌操作台。

冻存细胞解冻：取出细胞冻存管，37℃水浴快速振荡融化，控制融化时间不超过 2min，冻存管外壁喷洒 75% 乙醇消毒，转移至超净台，吸取全部细胞悬液移入装有完全培养基的离心管。

离心清除冻存液：离心机配平，室温 1000r/min 离心 5min，离心完成后缓慢倾倒丢弃上清液，保护管底细胞沉淀不被倒出。

细胞重悬与计数：加入预温完全培养基，使用移液管轻柔反复吹打细胞沉淀，充分打散细胞团块，吸取少量细胞悬液进行血细胞计数板计数，按照推荐细胞密度接种至培养瓶。

孵育贴壁培养：将接种完成的培养瓶平稳放置于 37℃，5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育，前 24 小时减少挪动，利于气管平滑肌细胞完成贴壁伸展。

换液及镜检：孵育 24h 后取出培养瓶，倒置显微镜观察贴壁情况，吸弃旧培养基，PBS 轻柔洗涤细胞单层，去除漂浮死细胞、组织碎片，补加新鲜完全培养基放回培养箱继续培养。

传代消化操作：细胞汇合至 80%‑85% 时，弃培养基，PBS 冲洗细胞层 2 次，加入胰酶‑EDTA 消化液，室温消化 3‑4min，镜下细胞皱缩变圆，加入培养基终止消化，吹打收集细胞，离心分瓶传代。