小鼠卵泡膜细胞

方法简介  实验室分离的小鼠卵泡膜细胞采用先机械分离后胶原酶消化结合Percoll密度梯度离心法、并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠卵泡膜细胞经3β-HSD免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠卵泡膜细胞专用培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠卵泡膜细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

卵巢取材与卵泡分离：取雌性小鼠，无菌处死后摘取卵巢组织，预冷 PBS 冲洗干净；显微镜下分离卵巢上中等大小卵泡，显微器械剥离卵泡外层卵泡膜组织，与内部颗粒细胞层分离开，收集卵泡膜组织碎片，PBS 漂洗。

组织剪碎预处理：将收集的卵泡膜组织碎片置于无菌培养皿，眼科剪剪切组织至 1 mm³ 细小碎块，PBS 洗涤组织碎块两次，吸除洗涤废液。

胶原酶消化解离组织：加入 Ⅰ 型胶原酶消化液，37℃水浴摇床消化 50‑70 min，每 15 min 轻柔吹打一次；待组织充分松散解离，加入含血清卵泡膜细胞完全培养基终止酶消化。

过滤离心获得细胞沉淀：消化悬液过 200 目无菌细胞筛滤除组织残渣；收集滤液，1100 r/min 离心 7 min，弃除上清废液，得到卵泡膜细胞沉淀。

重悬计数，细胞接种铺板：卵泡膜细胞完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，打散细胞团块；活细胞计数，调整细胞浓度接种至无菌培养瓶，置于 37℃、5% CO₂细胞培养箱孵育。

细胞培养换液以及传代：接种 24 h 全量换液去除悬浮死细胞，之后每 2‑3 d 更换新鲜培养基；细胞汇合度达到 80‑85%，胰酶消化，吹打制备单细胞悬液分瓶传代；减少传代次数防止细胞功能丢失。

细胞鉴定、冻存储备：采用 3β‑HSD 类固醇合成相关标志物鉴定卵泡膜细胞；无污染对数生长期细胞配置冻存液，程序梯度降温，液氮罐长期冻存；复苏快速融化，离心去除冻存保护剂再接种。