小鼠淋巴管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠淋巴管内皮细胞采用中性蛋白酶消化法结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠淋巴管内皮细胞经VEGFR3免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠淋巴管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠淋巴管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

组织取材分离预处理：选取小鼠耳廓、肠系膜组织作为取材来源，小鼠消毒处死后，无菌摘取耳廓或者肠系膜组织，置于预冷无菌 PBS；精细剔除脂肪、肌肉、血管等多余组织，PBS 多次冲洗组织血块杂质。

组织剪碎与复合酶消化：将目标组织剪碎至 1 mm³ 组织碎块，PBS 洗涤两次；加入胶原酶 Ⅰ+ 胶原酶 Ⅳ 复合消化液，37℃水浴摇床消化 50‑80 min，每隔 20 min 轻柔吹打，待组织松散，加入内皮细胞完全培养基终止消化。

过滤获得粗细胞悬液：消化后的混合悬液过 200 目、400 目双层无菌细胞筛，滤除未消化组织纤维残渣，收集全部过滤后的细胞悬液移入无菌离心管。

离心沉淀细胞，初步重悬：1200 r/min 离心 7 min，弃去上清废液；加入淋巴管内皮细胞专用完全培养基轻柔重悬底部细胞沉淀，充分打散细胞团聚块。

免疫磁珠纯化与细胞接种：利用 LYVE‑1 免疫磁珠分选富集淋巴管内皮细胞，去除血管内皮、成纤维细胞杂细胞；分选完成之后进行活细胞计数，接种于明胶包被的细胞培养器皿，放入 37℃、5% CO₂培养箱。

细胞培养、定期换液传代：接种 24 h 全量换液，去除死细胞与未结合磁珠碎片；之后每 2‑3 d 更换内皮完全培养基；细胞汇合至 80% 左右，胰酶温和消化分瓶传代，尽量使用低代次细胞。

细胞鉴定和液氮冻存：采用 LYVE‑1、Prox‑1 淋巴管内皮特异性标志物免疫荧光鉴定细胞纯度；状态优良无污染细胞配置内皮细胞冻存液，程序梯度降温，液氮罐长期保存。